Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.
심장 개발하는 동안, 심근 고유의 구조 및 기능 sarcomeres, 수축 근원 섬유, 인터 디스크를 포함하여 단위 및 costameres의 생성 시간과 공간의 여러 구성 요소의 조정 조립이 필요합니다. 이러한 구성 요소의 조립에 중단 발달 심장 결함으로 이어집니다. 면역 염색 기술은 근원 섬유 성숙을 조사하기 위해 배양 심근 세포에 일반적으로 사용되지만,이 생체 접근 방식은 근육 세포가 완전히 내막 큐의 문화, 정상적인 생체 기계 입력의 부족, 부재에서 차별화 할 수있는 범위에 의해 제한된다. 마우스 심장을 개발하는 연구에 면역 형광 기술을 사용하는 것이 바람직하지만, 기술적으로 도전, 및 방법은 종종 심장 개발의 초기 단계에 sarcomeres을 시각화하기에 충분한 감도 및 해상도가 부족하다. 여기서 우리는 뮤 발현 사이의 공동 강력하고 재현 가능한 방법을 설명ltiple 단백질이나에 배아 마우스 마음에 면역 염색 형광 단백질을 공동으로 시각화하고 개발 근원 섬유, 인터 디스크, costameres을 분석하기 위해이 방법을 사용합니다. 이 방법은 더 발달 심장 결함으로 이어질 돌연변이에 의한 심근 세포의 구조적 변화를 평가하기 위해 적용될 수있다.
심근 세포는 중간 선으로 마이그레이션 및 선형 심장 튜브 1, 2를 형성 한 후 개발하는 동안, 심장 수축 곧 시작합니다. 근절은 심근 내에서 기본 수축 단위; 이 고도의 조직 세포 골격 구조는 sarcomeric α-티닌 (S-α-티닌)와 M 라인에 고정 미오신 섬유 (그림 1)에 의해 Z 디스크에 고정 액틴 필라멘트를 포함하고 있습니다. 심근 세포가 성숙, sarcomeres는 셀을 가로 질러 연장 근원 섬유를 형성하기 위해 직렬로 조립한다. 근원 섬유는 인터 디스크에 의해 심근의 끝 부분에 고정되어, 같은 S-α-actinin의 3, adherens으로 Z-디스크 요소의 부분 집합을 과도 접합을 포함하는 세포 – 세포 접합부 구조 등 N-cadherin의 등의 접합 단백질 및 β 카테닌의, 간극 결합 단백질 및 데즈 모섬 (도 1) 4. 길이 막, 말초 근원 섬유의 Z-디스크 따라costameres 통해 세포막에 부착; 이러한 전문 초점 유착 (도 1) 4- 근원 섬유, 세포막 및 심근 추가적인 구조적지지를 제공하는 세포 외 기질 간의 앵커를 제공한다. 초기 심장 개발, 심근은 심실 공간으로 돌출 상대적으로 성숙 근원 섬유 (5)를 포함 trabeculae로 알려진 손가락 모양의 돌기에 배치되어있다. 심장 개발이 진행됨에 따라, 서브 외막 영역 심근 심실 벽을 포함하지만, 근절 및 근원 섬유 조립체 섬유주 심근 5,6- 비하여 지연되는 콤팩트를 형성하는 심근 증식.
근절 및 근원 섬유 조립체의 모델 배양 간단하지만 삼차원 환경 혈류 부족 심근 7-10, 및 기타 심장 세포와 접촉에 면역 연구는 크게 올생체에 존재에요. 배아의 중심부에 면역을 사용하여 고해상도 구조 연구는 기술적으로 도전이며, 몇몇 연구는 마우스 심장 개발하는 동안 인터 디스크와 costameres의 출현을 살펴 보았다. catenin의 β adherens 접합 단백질은 배아 하루 인터 디스크 (E) 17.5 (11), N-cadherin의 발현이 출생 후의 일 0 13 대 E18.5 (12)에 의한 인터 디스크를 나타낼 수있는 선형 구조 지역화 및 costameres이 검출 된 것으로 지역화 나타납니다 E18.5 (14)하지만, 이러한 단백질은 초기 개발 시점 11-13에서 확산 등을 지속적으로 막 분포를 표시합니다.
여기서 우리는 intercala의 출현을 포함하여 근원 섬유 및 심근 개발의 상세한 분석, 허용 면역 염색과 구분 마우스 배아 마음의 형광 현미경을위한 간단하고 재현성있는 방법을 설명테드는 초기 E12.5 및 E16.5에서 초기 costameres으로 디스크에 기록 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 근절 형성뿐만 아니라 근원 섬유 및 심근 성숙에 돌연변이의 효과를 프로빙 유용 할 수 있습니다.
최적의 조직 고정술 희석 경험적 각 항체에 대해 결정되어야한다. 우리의 손에, 스냅인 동결 S-α-티닌, β-catenin이, β1-인테그린, 트로포, talin (도시하지 않음)과 N-cadherin의 등 여러 심근 항원에 대한 PFA 고정 우수하다; 대조적으로, PFA 고정 초점이 부착 키나제 우수한 결과를 얻을 수 (도시 생략). PFA에 의해 형성된 가교 된 단백질은 항원과 항체의 결합 한계를 마스크 할 수있다; 항원 회수가 같은 경우에 요구 될 수 있고, 항원 및 검색을위한 방법은 다른 장소를 찾을 수있다 (20). PFA 농도 또는 고정 길이의 경험적 각 항체 각 발달 단계에서 결정된 최적의 조건으로, 에피토프 마스킹을 줄이기 위해 감소 될 수있다. 차 항체 제어와 같은 사전 면역 혈청과 "아니오 차 항체"공동을 포함하는 새로운 항체 또는 심장 돌연변이를 특성화 할 때 적절한 음성 대조군이 사용되어야한다ntrol. 녹아웃 마우스의 사용은 이상적인 음성 대조군하지만 초기 치사율은 여기에 연구 된 유전자 여러 제품의 사용을 방지 할 수 있습니다.
적당한 볼륨의 사용은 완전히 같은 면역 형광 차단, 항체 실험 및 제어 슬라이드를 잠수하고, 솔루션 섹션의 균일 한 노출을 보장하기 위해 배양시 슬라이드의 부드러운 락이었다로 세척 솔루션은 중요했다. 이 방식은 실험에서 섹션과 슬라이드 사이 염색 기술적 변동성을 최소화. 비용은 항체 용액의 부피를 제한하는 경우, 조직 절편을 넘어 용액의 유동을 제한하고 장시간 동안 인큐베이션 가습 챔버 내에서 슬라이드 유지 자궁암 펜을 사용. 모노클로 날 마우스 일차 항체 경우 -, 따라서 항 – 마우스 이차 항체 – 사용되고, 내인성 마우스 면역 글로불린을 덮도록 제 블로킹 단계는 비특이적 배경 신호를 감소시킬 필요가 (단계 3.4) 일 것이다.
적절한 현미경과 이미지 처리 기술은 생물학적으로 정확한 정보 (21)를 얻는 데 중요합니다. 각 색상 – (16 비트 이미지를위한 레벨 0 65535) 크기 히스토그램은 각각의 휘도 레벨에서의 픽셀들의 분포를 나타낸다. 배경, 밝기 및 콘트라스트 히스토그램 피크 의하여 측면 강도 표시 범위를 설정함으로써 조정될 수있다; 조건 사이의 유효한 비교를 위해, 제어 및 실험 조건과 동일한 설정을 사용해야합니다.
이 프로토콜은 기본 배아 마우스 심장에서 심근 세포의 성숙과 발전을 분석 할 수있는 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 심근 세포 특이 단백질의 면역 형광은 종종 개발 중에 심근 세포를 표시하는 데 사용되지만, 몇몇 연구는 고해상도 근원 섬유 구조의 분석 및 인터 디스크 및 costameres 12-14,22,23의 출현을 허용 기법을 이용한다. 이 기술은 V에서 사용될 수있다구조적 이상 메커니즘을 밝혀있다 심근 성숙의 변화를 파악하는 수단으로서, 발달 심장 결함을 일으킬 돌연변이 IVO 평가.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Drs. Hilary Clay, Stephen Wilson, Anna Payne-Tobin, and James Smyth for helpful discussions. Microscopy was done at the Cardiovascular Research Institute Imaging Core at the University of California, San Francisco. This work was supported by NIH K08 HL105657 (LDW) and NIH HL65590 (SRC).
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cryomold, Disposable Base Mold, 7×7 mm | Richard-Allen Scientific | 58949 | This size not available from Fisher Scientific |
Cryomold, Disposable Base Mold, 15×15 mm | Fisher Scientific | 22-050-159 | Also available from Richard-Allen Scientific, catalog number 58950 |
Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) medium 4583 | VWR | 25608-930 | |
2-methyl butane | Sigma | M32631 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353-500 | Use fresh 4% solution in 1X PBS, pH 7.2-7.4. |
Sucrose | Sigma | S0389 | Use 15% and 30% solutions in 1X PBS. |
Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | S30467-1 | |
Superfrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | "Plus" indicates positively-charged coating and is critical for maintaining tissue adherence to the slide. |
Acetone | Sigma | 179124 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Western Blocking Agent | Roche | 11921673001 | Blocking buffer for immunofluorescence, when secondary antibodies are from different species. Dilute to 1X in PBS. |
Tween 20 | Sigma | P9416 | |
Donkey Anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | Goat Anti-mouse IgG (H+L) also available. For blocking endogenous immunoglobulins. |
Anti-s-a-actinin antibody | Sigma | A7811 | Mouse monoclonal, clone EA53. Dilute 1:400 for snap-frozen/acetone-fixed sections, dilute 1:300 for PFA-fixed sections. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
Anti-bcatenin antibody | Cell Signaling | 9587s | Rabbit polyclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:400. |
Anti-b1 integrin antibody | R&D | AF2405 | Goat polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
Anti-tropomyosin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | CH1 | Mouse monoclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
Anti-N-cadherin antibody | Santa Cruz | sc-7939 | Rabbit polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
Anti-talin antibody | Sigma | T3287 | Mouse monoclonal, clone 8d4. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
Anti-phosphotyrosine 397 focal adhesion kinase antibody | Invitrogen | 700255 | Rabbit monoclonal antibody. Requires PFA fixation. Dilute 1:500. |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-21202 | |
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | |
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Antibody | Life Technologies | A-11011 | |
Hoechst 33342 dye | Life Technologies | H3570 | Nuclear stain |
Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
MLC 400B Monolithic Laser Combiner Laser box | Keysight (formerly Agilent) | ||
Clara Interline CCD camera | Andor | ||
Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | ||
CSU-X1 Spinning disk confocal scanner unit | Yokogawa | ||
CFI Plan Apochromat 4X air objective | Nikon | Numerical aperture (NA) 0.2, Working distance (WD) 15.7 mm | |
CFI Plan Apochromat VC 60x oil immesion objective (MRD01602) | Nikon | NA 1.4, WD 0.13 mm | |
NIS Elements Imaging Software | Nikon | http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm | |
Image analysis software | Fiji | http://fiji.sc/Fiji |