Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.
期间心脏发育,心肌特异性的结构和功能单位,其中包括肌节,肌原纤维的收缩,闰盘,并costameres产生需要多个部件的在时间和空间的协调组件。破坏这些组件组装导致发育心脏缺陷。通常使用免疫荧光染色技术在培养的心肌细胞,以探测肌原纤维的成熟,但这种体外方法由程度上限制向其中细胞将充分分化培养心内膜线索,缺乏正常体内机械输入,和不存在。免疫荧光技术来开发小鼠心脏研究中的应用是可取的,但更多的技术上的挑战,和方法往往缺乏足够的灵敏度和分辨率,可视化肌节的心脏发育的早期阶段。在这里,我们描述了一个强大的和可重复的方法共同免疫染色万亩ltiple蛋白质或共同与可视化免疫荧光染色荧光蛋白在小鼠胚胎心脏,用这种方法来分析发展中的肌原纤维,闰盘和costameres。该方法可进一步用于评估突变引起的,导致发育心脏缺陷的心肌的结构变化。
在开发过程中,心脏收缩开始后不久,心肌细胞移植到中线,形成线性心脏管1,2。肌节是心肌细胞内的基本收缩单位;这个高度组织细胞骨架结构包含锚定于Z盘由肌节α辅肌动蛋白(S-α辅肌动蛋白)和肌球蛋白纤维锚固到M个行( 图1)的肌动蛋白丝。作为心肌的成熟,肌节组装串联形成肌原纤维跨越小区延伸。肌原纤维由闰盘固定在心肌细胞的端部,包含与Z-盘元素如S-α辅肌动蛋白3,粘着的一个子集的过渡交界处的细胞间交界结构连接蛋白,例如N-钙粘蛋白和β连环蛋白,间隙连接蛋白,和桥粒( 图1)4。沿着纵向膜,在Z光盘周肌原纤维也附加到经由costameres细胞膜;这些专门粘着斑提供的肌原纤维,质膜,和细胞外基质,以提供对心肌额外的结构支撑之间的锚定( 图1)4。早在心脏发育,心肌细胞排列在称为小梁手指状突起伸入所述室的空间和包含相对成熟的肌原纤维5。作为心脏发育的进行,在副心外膜区域的心肌细胞增殖,以形成紧凑的心肌,其包括心室壁,但肌节肌原纤维和组件被延迟与小梁心肌5,6相比较。
肌节肌原纤维和组件的模型主要来自免疫荧光研究对培养心肌细胞的7-10,这是简单的,但缺乏的三维环境中,血流量,并与其他的心脏细胞接触S出现在体内,小鼠胚胎心脏免疫高分辨率结构的研究在技术上具有挑战性,而且很少有研究探索闰盘和costameres小鼠心脏发育过程中的出现。该粘着连接蛋白β连环似乎定位于闰盘由胚胎天(E)17.5 11,N-cadherin的本地化到可能代表闰盘由E18.5 12与0 13日龄线性结构,并costameres都在被检测E18.5 14,但这些蛋白显示在早期发育时间点11-13漫射和更连续膜分布。
在这里,我们描述了染色和切片小鼠胚胎心脏的荧光显微镜一个简单的和可重复的方法,允许肌原纤维和心肌细胞的发展进行详细分析,包括intercala的出现泰德早在E12.5和新生costameres在E16.5光盘。该协议可以是用于探测上肌节的形成以及肌原纤维和心肌细胞的成熟突变的影响是有用的。
最佳组织固定技术和稀释必须为每个抗体凭经验确定。在我们手中,搭扣冷冻优于PFA固定数心肌抗原,包括S-α辅肌动蛋白,β连环蛋白,β1整联,原肌球蛋白,塔林(未示出)和N-钙粘蛋白;与此相反,PFA固定得到优异的结果为粘着斑激酶(未示出)。由PFA形成的蛋白质交联可能掩盖表位和限价抗体结合;抗原修复,可能需要在这样的情况下,以及用于抗原修复方法可在别处20找到。 PFA浓度或固定的长度可以减小,以减少表位掩蔽,以最佳条件对于每个抗体,并在每个发育阶段经验确定。当表征一个新的抗体或心脏突变体,包括免疫前血清作为初级抗体对照和一个“无第一抗体”共同适当的阴性对照,应使用ntrol。使用基因敲除小鼠是一种理想的阴性对照,但早期致死防止它们的使用对许多这里所研究的基因产物。
使用足够量以完全淹没实验组和对照载玻片在同一免疫阻断,抗体,并作为是幻灯片的孵育期间温和的摇摆,以确保各部分的解决方案的均匀曝光洗涤溶液是重要的。这种方法最小化技术变化在一个实验中的章节和幻灯片之间染色。当成本限制了抗体溶液的体积,用巴氏笔来限制流量的解决方案超出了组织切片,并在漫长的孵化保持在湿润的玻片。如果一个单克隆小鼠一次抗体 – 并且因此抗小鼠次级抗体 – 正在被使用,第二阻挡步骤以覆盖内源性小鼠免疫球蛋白将是必要的(步骤3.4),以减少非特异性背景信号。
适当显微镜和图像处理技术是在获得生物准确信息21是至关重要的。所述强度直方图表示像素的各个强度等级的分布(0 – 65535的水平为16位的图像),用于每种颜色。背景,亮度和对比度可以通过设置侧翼直方图峰的强度显示范围进行调整;使条件之间有效的比较,必须使用对照组和实验条件之间的相同的设置。
该协议提供了分析心肌细胞的成熟和发展,在本土胚胎小鼠心脏的可靠方法。而心肌细胞特异性蛋白的免疫荧光常常用于标记发展过程中的心肌细胞,少数研究采用的技术,使肌原纤维结构的高分辨率分析和闰盘和costameres 12-14,22,23的出现。此技术可用于在VIVO评估突变,导致发育心脏缺陷,作为查明改变心肌细胞的成熟,可能揭示结构异常的机制的光的装置。
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Drs. Hilary Clay, Stephen Wilson, Anna Payne-Tobin, and James Smyth for helpful discussions. Microscopy was done at the Cardiovascular Research Institute Imaging Core at the University of California, San Francisco. This work was supported by NIH K08 HL105657 (LDW) and NIH HL65590 (SRC).
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cryomold, Disposable Base Mold, 7×7 mm | Richard-Allen Scientific | 58949 | This size not available from Fisher Scientific |
Cryomold, Disposable Base Mold, 15×15 mm | Fisher Scientific | 22-050-159 | Also available from Richard-Allen Scientific, catalog number 58950 |
Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) medium 4583 | VWR | 25608-930 | |
2-methyl butane | Sigma | M32631 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353-500 | Use fresh 4% solution in 1X PBS, pH 7.2-7.4. |
Sucrose | Sigma | S0389 | Use 15% and 30% solutions in 1X PBS. |
Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | S30467-1 | |
Superfrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | "Plus" indicates positively-charged coating and is critical for maintaining tissue adherence to the slide. |
Acetone | Sigma | 179124 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Western Blocking Agent | Roche | 11921673001 | Blocking buffer for immunofluorescence, when secondary antibodies are from different species. Dilute to 1X in PBS. |
Tween 20 | Sigma | P9416 | |
Donkey Anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | Goat Anti-mouse IgG (H+L) also available. For blocking endogenous immunoglobulins. |
Anti-s-a-actinin antibody | Sigma | A7811 | Mouse monoclonal, clone EA53. Dilute 1:400 for snap-frozen/acetone-fixed sections, dilute 1:300 for PFA-fixed sections. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
Anti-bcatenin antibody | Cell Signaling | 9587s | Rabbit polyclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:400. |
Anti-b1 integrin antibody | R&D | AF2405 | Goat polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
Anti-tropomyosin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | CH1 | Mouse monoclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
Anti-N-cadherin antibody | Santa Cruz | sc-7939 | Rabbit polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
Anti-talin antibody | Sigma | T3287 | Mouse monoclonal, clone 8d4. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
Anti-phosphotyrosine 397 focal adhesion kinase antibody | Invitrogen | 700255 | Rabbit monoclonal antibody. Requires PFA fixation. Dilute 1:500. |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-21202 | |
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | |
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Antibody | Life Technologies | A-11011 | |
Hoechst 33342 dye | Life Technologies | H3570 | Nuclear stain |
Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
MLC 400B Monolithic Laser Combiner Laser box | Keysight (formerly Agilent) | ||
Clara Interline CCD camera | Andor | ||
Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | ||
CSU-X1 Spinning disk confocal scanner unit | Yokogawa | ||
CFI Plan Apochromat 4X air objective | Nikon | Numerical aperture (NA) 0.2, Working distance (WD) 15.7 mm | |
CFI Plan Apochromat VC 60x oil immesion objective (MRD01602) | Nikon | NA 1.4, WD 0.13 mm | |
NIS Elements Imaging Software | Nikon | http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm | |
Image analysis software | Fiji | http://fiji.sc/Fiji |