Protocolos para la obtención de embriones somáticos y cigóticos para el estudio de la regulación del desarrollo embrionario temprano en el Modelo de Leguminosas<em> Medicago truncatula</em
Summary
The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.
Abstract
La embriogénesis temprana a partir de una sola célula cigoto pasa a través de una rápida división celular y la morfogénesis, y se caracteriza morfológicamente por etapas pre-globular, globulares, corazón, de torpedos y de cotiledones. Este desarrollo progresivo está bajo la regulación estricta de una red molecular compleja. La recolección de suficientes embriones tempranos en una etapa similar de desarrollo es esencial para la investigación de la regulación celular y molecular de la embriogénesis temprana. Esto no es directo desde la embriogénesis temprana sufre morfogénesis rápido en un corto periodo de tiempo, por ejemplo 8 días para Medicago truncatula para llegar al estadio de cotiledones temprano. Aquí, abordamos el tema por dos enfoques. El primero establece una vinculación entre el desarrollo del embrión y la morfología pod en ayudar a indicar la etapa del embrión cigóticos. Esto se basa sobre todo en el número de espirales de la vaina y el desarrollo de las espinas. Una forma alternativa para complementar la in vivo sos estudios es a través de explantes de hoja de cultivo para producir embriones somáticos. El medio incluye una combinación de hormonas inusual – una auxina (ácido 1-naftalenacético), una citocinina (6-bencilaminopurina), el ácido abscísico y ácido giberélico. Las diferentes etapas se pueden discernir que crece fuera del callo sin disección.
Introduction
Las legumbres son la tercera familia más grande de plantas superiores, con aproximadamente 20.000 especies y el (o Fabaceae) familia de las leguminosas son segundos a los cereales en la superficie cosechada y la producción total 1. La soja es el cultivo cultivado tercera más grande. Leguminosas de grano proporcionan alrededor de un tercio de la proteína dietética y un tercio de aceite vegetal para el consumo humano 2. Legumbres con su capacidad de fijación de N2 también contribuyen a los sistemas agrícolas sostenibles. Medicago truncatula, como la soja, las tiendas de proteína y aceite en los cotiledones de las semillas y es una leguminosa modelo genética y genómica con considerables recursos genéticos y genómicos 3,4. Mientras M. truncatula ha permitido avances en la comprensión de la leguminosa simbiosis Rhizobium 4 se ha empleado cada vez más para estudiar la biología de semillas de leguminosas 5-7 y embriogénesis 8,9. Embriogénesis Arabidopsis ha sido ampliamente estudiado 10,11 pero isa no leguminosas y los detalles de la embriogénesis no son idénticos a Medicago 8,10. Embriogénesis cigóticos en M. truncatula tiene características interesantes, con un hipófisis multicelular distintivo, un suspensor endoployploid y transferencia de células basales 8.
La embriogénesis somática (SE) se utiliza comúnmente para la regeneración de plantas 12. En el modelo de leguminosas M. truncatula, la línea de semillas Jemalong 2HA (2HA) se ha desarrollado a partir de la matriz Jemalong tener altas tasas de embriogénesis somática 13. El número de embriones producidos recientemente se ha incrementado sustancialmente por la adición tanto de ácido giberélico (GA) y ácido abscísico (ABA) al medio de largo establecido 14. En este caso, GA y actuar sinérgicamente ABA, que es inusual dado que GA y ABA generalmente actúan antagónicamente 14. Los embriones producidos a partir de callos se desarrollan en la superficie que permite la etapa de la embriogénesis a ser determinada fácilmente Visually cosechado y fácilmente. Tener cerca de líneas isogénicas que son embriogénico (2HA) y no embriogénico (Jemalong) facilita la investigación de la embriogénesis somática y que tiene tanto in vivo como sistemas in vitro proporciona diferentes posibilidades experimentales.
La comprensión de los mecanismos celulares y moleculares del desarrollo embrionario es esencial para la comprensión de semillas y desarrollo de la planta. En las legumbres, como en otras dicotiledóneas, son los cotiledones del embrión que almacenan los productos que se utilizan para la nutrición humana. Embriogénesis temprana implica la división de células, y los patrones de embriones correcta. En aproximadamente 8 días después de la fecundación, el M. truncatula embrión alcanza etapas tempranas de cotiledones. La caracterización morfológica no se indica exactamente por día después de la fecundación en condiciones de invernadero. Por lo tanto, un enfoque estandarizado eficiente para indicar la etapa de embriones en desarrollo es valioso en el estudio de la genética Regulación de principios de la embriogénesis cigóticos.
En este trabajo, ofrecemos dos protocolos estandarizados para recoger embriones en desarrollo para estudios biológicos de la embriogénesis en el modelo de leguminosas M. truncatula. El primero es recoger embriones cigóticos asociando la embriogénesis y pod morfología mientras que la segunda es la embriogénesis somática a través de explantes de hoja de cultivo para proporcionar los números de embriones grandes de fácil acceso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los protocolos descritos son relativamente sencillo y permiten la investigación de la embriogénesis leguminosa con toda la célula contemporánea y técnicas moleculares. Reconocemos que hay ventajas y desventajas de ambos in vivo e in vitro enfoques. Ambos permiten un mayor enfoque en la embriogénesis temprana en comparación con la cultura de las semillas inmaduras 19.
En el caso de los estudios in vivo lo que se describe es predominantemen…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.
Materials
| P4 medium | Sigma-Aldrich | Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier | |
| Major salts | |||
| Minor salts | |||
| Vitamins | |||
| Agar | Bacto Laboratories | 214010 | Bacto agar |
| Plant hormones | |||
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| Abscisic acid | Sigma-Aldrich | A1049 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| 6-Benzylaminopurine | Sigma-Aldrich | B3274 | Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl |
| Gibberellic Acid | Sigma-Aldrich | G7645 | Dissolve in small amount of ethanol |
| Equipment | |||
| Stereo dissecting microscope | Leica | MZFLIII | Or similar |
| Light microscope | Zeiss | Axiophot | Or similar, with suitable optics |
| Digital camera | Zeiss | AxioCam HRc | Or similar |
| Sterilising leaves | |||
| 250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid | SARSTEDT | 75.9922.519 | Autoclavable |
Referenzen
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