Küçük Molekül-modüle Farklılaşma ve sonraki Glikoz şiddetli açlık kullanma İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin yüksek oranda saf kardiyomiyositlerde türetilmesi
Summary
Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.
Abstract
İnsan uyarılmış pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler) temel araştırma ve translasyonel uygulamaları için kullanılabilir birincil kardiyomiyositlerinin eksikliği gidermek için önemli bir hücre kaynağı haline gelmiştir. Kardiyomiyositlere hiPSCs ayırt etmek için, embriyoit gövdenin (EB) tabanlı türev ve büyüme faktörü indüksiyonu da dahil olmak üzere çeşitli protokoller geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu protokoller verimsiz ve saflaştırılmış kardiyomiyositlerde oluşturmak için yetenekleri açısından oldukça değişkendir. Son zamanlarda, Wnt / β-katenin sinyal, küçük bir molekül tabanlı bir protokol kullanılarak modülasyonu, yüksek verimlilik ile kardiyak farklılaşmasını teşvik ettiği gösterilmiştir. Bu protokol ile, farklılaşmış hücrelerin% 50'den daha fazla -60% kardiyak troponin pozitif kardiyomiyositler sürekli gözlendi idi. Ayrıca kardiyomiyosit saflığını arttırmak için, farklılaşmış hücre spesifik, metabolik bir fark temelinde-kardiyomiyositlerde ortadan kaldırmak için açlık glikoz tabi tutuldukardiyomiyositler ve non-kardiyomiyositlere arasındaki s. Bu seçim strateji kullanarak, sürekli olarak farklılaşmış bir hücre popülasyonunda olmayan kardiyomi kardiyomiyositlerin oranında% 30'dan fazla bir artış elde edilmiştir. Bu son derece saflaştırılmış kardiyomiyositlerde nitro hastalık modelleme çalışmaları ve ilaç tarama tahlillerinde İnsan iPSC tabanlı sonuçların güvenilirliğini geliştirmek gerekir.
Introduction
Primer insan kardiyomiyositler nedeniyle invaziv kardiyak biyopsiler, çünkü kültür yoksul uzun vadeli hücre canlılığı tek hücrelere dissociating zorluk için gereğinin elde etmek zordur. Birincil insan kardiyomiyositler, hastaya özgü insan uyarılmış pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit bu eksikliği göz önüne alındığında (hiPSC-CM) teknolojisi temel araştırma için güçlü bir alternatif kardiyomiyosit kaynağı yanı sıra hastalık modelleme ve ilaç olarak klinik ve translasyonel uygulamaları olarak kabul edilmiştir keşif 1. Kardiyomiyositlere pluripotent kök hücrelerin ayırt Erken çabaları embriyoid organları (EBS) ile farklılaşma protokolleri istihdam, ama bir EB hücrelerin genellikle az 25 den% kardiyomiyositlerde 2,3 yenerek çünkü bu yöntem üreten kardiyomiyositlerde verimsizdir. Nispeten, A ve BMP4 aktivin sitokinler kullanarak tek tabaka-tabanlı farklılaşma protokolü EBS daha yüksek verimlilik görüntülenen, ancakBu protokol, hala nispeten verimsizdir insan pluripotent kök hücre hatları 4, sınırlı sayıda pahalı büyüme faktörleri ve tek işlevleri gerektirir. Son zamanlarda, bir yüksek verimli, hiPSC tek tabaka-tabanlı kardiyomiyosit farklılaşma protokolü Wnt / β-katenin sinyal 5 modüle tarafından geliştirilmiştir. Bunlar hiPSC-CM'ler kardiyak troponin T ve alfa aktinin, kardiyomiyositlerinin 6 standart belirteçleri iki sarkomerik proteinleri ifade eder. protokol burada açıklamak bu küçük molekül tabanlı, besleyici, hücre içermeyen, tek tabaka farklılaşma yöntemi 5,7 bir uyarlamasıdır. Biz 7-10 gün (Şekil 1) sonra hiPSCs gelen kardiyomiyositlerde yenerek elde edebiliyoruz. Ancak,% 50 hücreleri yenerek sonuçlanan bir kardiyomiyosit farklılaşması takip, sürekli immün, kalp-özel troponin T ve alfa-aktinin olarak kardiyomiyosit-spesifik belirteçler için negatif olmayan kardiyomiyositlerin bir nüfusun varlığını göstermektedir. Fu içinrther kardiyomiyositlerde saflaştırılması olmayan kardiyomiyositlerde ortadan kaldırmak, heterojen farklılaşmış hücre popülasyonları birden fazla gün boyunca son derece düşük bir glikoz kültür ortamı (Şekil 2) ile muamele etmek suretiyle açlık glikoz tabi tutuldu. Bu tedavi seçici düşük glukoz ortamında 8 hayatta kalmak için birincil enerji kaynağı olarak laktat metabolize kardiyomiyositlerin yeteneği nedeniyle sigara kardiyomiyositlerde, ancak sigara kardiyomiyositler, ortadan kaldırır. Bu saflaştırma adımından sonra, sigara kardiyomi kardiyomiyositlerin oranında% 40'lık bir artış (Şekil 3, Şekil 4), görülmektedir ve bu hücreler, aşağı doğru gen ifade analizi, hastalık modelleme ve ilaç tarama deneyleri için de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yüksek ölçüde saflaştırılmış hiPSC türetilmiş kardiyomiyositlerin büyük miktarda elde temel kardiyak araştırmalar ve klinik ve çeviri uygulamalar için kritik önem taşır. Kalp farklılaşma protokolleri küçük molekül-modüle ve tek tabaka-temelli yöntemler 5 nihayet kardiyojenik büyümeyi kullanan embriyoid vücut temelli yöntemlerden geçiş, son yıllarda muazzam gelişmeler geçirmiş sandviç yöntemleri 12 matris, 2 faktörleri, ve var. Anılan protokol, bu…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the NIH/NHBI (U01 HL099776-5), the NIH Director’s New Innovator Award (DP2 OD004411-2), the California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), the American Heart Association (14GRNT18630016) and the Endowed Faculty Scholar Award from the Lucile Packard Foundation for Children and the Child Health Research Institute at Stanford (to SMW). We also acknowledge funding support from the American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000, and National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| Matrigel (9-12 mg/mL) | BD Biosciences | 354277 |
| RPMI media | Invitrogen | 11835055 |
| Glucose free RPMI media | Invitrogen | 11879-020 |
| B27 Minus Insulin | Invitrogen | A1895601 |
| B27 Supplement (w/ insulin) | Invitrogen | 17504-044 |
| Pen-strep antibiotic | Invitrogen | 15140122 |
| Fetal bovine serum | BenchMark | 100-106 |
| DMSO | Sigma | D-2650 |
| ROCK inhibitor Y-27632 | EMD Millipore | 688000 |
| CHIR99021 | Thermo Fisher | 508306 |
| IWR1 | Sigma | I0161 |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 |
| Accutase | Millipore | SCR005 |
| Cell lifter | Fisher | 08-100-240 |
| Cryovial | Fisher (NUNC tubes) | 375418 |
| TrypLE Select Enzyme | Invitrogen | 12563-011 |
Referenzen
- Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4 (6), 150 (2013).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).
- Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation. Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
