JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Biotechnik

Arrays Sealable Femtoliter Câmara de Biologia livre-Cell

Published: March 11, 2015
doi:
10.3791/52616
, , , , , ,
1Bredesen Center,University of Tennessee, Knoxville, 2Center for Nanophase Materials Sciences,Oak Ridge National Laboratory, 3Department of Materials Science and Engineering,University of Tennessee, Knoxville

Summary

A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

Abstract

Sistemas isentos de células, proporcionam uma plataforma flexível para sondar redes específicos de reacções biológicas isoladas a partir do complexo de partilha de recursos (por exemplo, a expressão genética global, a divisão celular) encontradas no interior de células vivas. No entanto, tais sistemas, utilizados em reactores granel macro-escala convencionais, muitas vezes não conseguem demonstrar os comportamentos dinâmicos e eficiências característicos dos seus homólogos em micro-escala de vida. Compreender o impacto da estrutura celular interna e escala na dinâmica de reação é crucial para entender redes de genes complexos. Aqui nós relatamos um dispositivo que limita microfabricated reações livres de células em volumes escala celulares, permitindo a caracterização flexível do sistema molecular fechado. Esta poli multicamadas (dimetilsiloxano) (PDMS) dispositivo contém câmaras de reação femtoliter escala em uma membrana elastomérica que pode ser accionado (aberta e fechada). Quando acionada, as câmaras de confinar Proteína-Free Cell síntese (CFPS) Reacçõesexpressando a proteína fluorescente, permitindo a visualização da cinética de reação ao longo do tempo, através de microscopia fluorescente time-lapse. Aqui demonstramos como este dispositivo pode ser usado para medir o ruído de estrutura reacções CFPS de uma forma que é directamente análoga à usada para caracterizar os sistemas celulares, permitindo assim a utilização de técnicas de biologia ruído utilizados em sistemas celulares para caracterizar circuitos de genes e CFPS suas interações com o meio ambiente livre de células.

Introduction

Sistemas livres de células oferecer uma plataforma simplificada e flexível que permite visualizar reações biológicas livre de fatores complicadores, como fitness, divisão e mutação que são inevitáveis ​​no estudo de células vivas. Essas abordagens têm sido utilizados para estudar os sistemas celulares, incluindo a caracterização de proteínas de membrana 1, a sondagem de interações protéicas 2, e a exploração de aspectos fundamentais da tradução 3-7. Recentemente sistemas livres de células começaram a ganhar uma posição como plataformas viáveis ​​para a biologia sintética 8-10. O apelo de tais abordagens é que eles liberar a biologia sintética a partir do compartilhamento de recursos e "ruído extrínseco" que afeta a dinâmica de reação em células vivas. No entanto questões permanecem sobre a forma como o ambiente físico no qual as reacções de células livres são incorporados afecta a progressão e resultado da reacção. Ambientes de reação sem células – environm particularmente confinadoentos que abordam volumes de células relevante – permanecem pouco caracterizados. Proteína-Free Cell Synthesis (CFPS) é o pensamento convencional como sendo "livre de escala", exibindo cinética equivalentes em toda uma gama de microlitro para volumes de reação litro escala 11. No entanto, as reações confinantes para volumes escala celulares foi mostrado para afetar significativamente as taxas de expressão de proteínas 12.

A natureza estocástica de reações livres de células – especialmente como estes abordagem de sistemas ou até mesmo ir abaixo femtoliter volumes – pode ser de particular importância. O ruído na expressão de genes é uma propriedade muito influenciado por confinamento como volumes de células pequenas e elevadas densidades de componentes forçar muitas das moléculas importantes para os níveis populacionais muito baixas – por exemplo, de Escherichia coli dentro de limites num volume de 1 fl até 4.300 polipéptidos diferentes sob o controlo indutivel de várias centenas de diferentes promotores 13. Este ruído inerente tem sido apontada como uma força motriz central em numerosos processos biológicos, incluindo a quimiotaxia 14, a decisão HIV entre replicação ativa e latência de 15, a decisão λ fago entre lise e lysogeny 16,17, ea decisão Bacillus subtillus entre competência e esporulação 17. Biologia sintética livre de células, em seguida, fornece uma oportunidade para explorar as propriedades estocásticos de circuitos de genes celulares e redes, e manipular esses comportamentos para atingir as metas tecnológicas específicas. Embora o comportamento de ruído de sistemas celulares tem sido bem estudado 18-27, tem havido pouca exploração do comportamento de ruído fundamental de sistemas isentos de células, 8, particularmente à escala celular.

Aqui apresenta-se uma plataforma para o estudo dos efeitos estocásticos em biologia sintética livre de células. Esta plataforma microfabricated contém femtoliter escala reação cHambers que podem ser rapidamente transitaram entre aberto (livre difusão dentro e para fora da câmara) e fechados (reagentes confinados dentro da câmara) estados. No estado fechado, nós confinar da síntese da proteína (CFPS) reagentes-Free Cell que expressam uma proteína verde fluorescente (GFP), e siga a expressão do gene usando microscopia de fluorescência de lapso de tempo de 28 (Figura 1). Nós caracterizar este ambiente isento de células, medindo a estrutura das flutuações estocásticos na expressão do gene de uma forma directamente análoga à utilizada para caracterizar as células 25. Os métodos não-microfabricação para confinar reações livres de células incluem vesículas e lipossomas 29-32, emulsões água-em-óleo 12 e 33 meios porosos. No entanto, enquanto estes métodos podem proporcionar um controlo sobre a distribuição do tamanho dos volumes confinados 34, os métodos de microfabricação criar características altamente reprodutíveis com dimensões especificadas firmemente, mesmo em nanoescala.Além disso, estas estruturas rígidas podem ser facilmente controladas ao longo do tempo sem ser susceptível de evaporação ou alterações no ambiente externo. Modelos de recipientes utilizados em microfabricados 8,35 trabalho anterior não pode selar rapidamente as câmaras de reacção após o início da reacção, o que complica a atribuição clara do momento em que a reacção foi iniciada (tempo zero). Usando o método aqui apresentado, são necessários apenas 4-5 min entre a iniciação e a visualização da reacção sobre o dispositivo, proporcionando assim uma estrutura bem definida "tempo zero". Os seguintes protocolos de descrever os métodos para fabricar e testar este dispositivo, incluindo a litografia óptica, a montagem do dispositivo, o teste do dispositivo, e métodos para análise de imagem.

Protocol

1. litografia óptica de Mestres do Dispositivo Desidratar bolachas de silício limpas em uma placa quente a ~ 250 ° C durante pelo menos 1 hr. NOTA: É uma boa prática para usar mais de um wafer ao preparar um mestre, em caso de erro do usuário. Preparar alíquotas fotossensíveis. Preparar alíquotas de ambos SU-8 2015 fotorresistente e uma diluição de SU-8 2015 fotorresistente na proporção 2: 1 utilizando SU-8 mais fino como diluente. NOTA: Cerca de 1 ml de material fotosensitivo é necessária para revestimento por rotação uma bolacha. Prepare três padrões de máscara para a produção destes mestres. Para a membrana Mestre, preparar duas máscaras: uma padronização do canal de membrana e o outro padronização das câmaras de reacção. Para o mestre válvula de controle, preparar apenas um padrão de máscara. NOTA: Para mais detalhes sobre técnicas de litografia, incluindo padronização máscara, consulte Ito e Okazaki, 2000. 36 See Fowlkes e Collier, 2013 para uma descrição mais detalhada do projeto do dispositivo 37. Preparar a membrana mestre Spin-revestimento 2: 1 SU-8 diluição 2,015 fotorresistente em wafers a 1.000 rpm durante 45 seg. Assar bolachas moles a 95 ° C durante 2 min. Usando um alinhador de contacto, expor bolachas com padrão de canal de membrana durante 10 segundos, e realizar um cozimento pós-exposição durante 2 min a 95 ° C. Desenvolver bolachas em SU-8 desenvolvedor durante 1 min, ou até que os resíduos fotossensível é removido. Lavar bolacha com isopropanol, movendo-se de cima para baixo. Wafer com azoto seco, mais uma vez em movimento de cima para baixo. Bolachas Cozer a 180 ° C durante 4 min. Spin-revestimento modelado bolachas novamente com 2: 1 SU-8 diluição a 2.000 rpm durante 45 seg. Assar bolachas modelado suave durante 2 min a 95 ° C. Usando contato alinhador, alinhe wafers modeladas com padrão câmara de reação, e expor por 10 s. Realizar coza pós-exposição durante 2 min a 95 ° C. Desenvolver pastilhas como descrito no passo 1.4.3. Depois de desenvolver e secagem wafers, bolachas Asse em forno a 180 ° C por 4 min. NOTA: As bolachas podem ser desenvolvidas no mesmo programador que foi utilizado no passo anterior. Prepare a Válvula de Controle Mestre Spin-coat não diluído SU-8 photoresist sobre lâminas limpas a 2.000 rpm durante 45 seg. Coza bolacha mole a 95 ° C durante 6 min. Usando um alinhador de contato, expor bolachas com padrão de válvula de controle por 10 s. Realize uma assar pós-exposição a 95 ° C por 6 min. Desenvolver bolachas em SU-8 Developer durante 2 minutos, ou até que os resíduos sejam removidos. Lavar com isopropanol, movendo-se de cima para baixo. Bolacha a seco com azoto e cozer no forno a 180 ° C durante 4 min. 2. PDMS fabricação de dispositivos Silanizar todos os mestres com ~ 0,2 ml trimetilclorosilano via deposição de vapor. Coloque rapidamente o mestre em um recipiente hermético, em temperatura ambiente com algumas gotas de agente de silanização. NOTA:. Outros protocolos silanizar pode ser aceitável 38 Se properl realizaday, o PDMS será fácil de remover. Misturar um poli comercial (dimetilsiloxano) (PDMS) de base e agente de cura, em diferentes proporções para as camadas tanto da válvula de membrana e de controlo do dispositivo, tal como foi demonstrado em multicamadas válvula semelhante projeta 39. Usar 20: 1 e 5: 1 de rácios de base: agente de cura para os moldes de membrana e de válvulas de controlo, respectivamente. Para o molde de membrana, misturar 10 g de base com 0,5 g de agente de cura. NOTA: Este volume será spin-revestido sobre o mestre membrana. Para o molde de válvula de controlo, a mistura de base e agente de cura na proporção de 5: 1. A quantidade de PDMS necessárias para moldar a válvula de controlo irá depender do recipiente utilizado para armazenar a válvula de controlo principal; encher o recipiente de tal modo que o mestre é revestida com ~ 1 cm de PDMS. Misture bem tanto PDMS preparações, e desgaseificar-los em uma câmara de vácuo até que não haja bolhas de ar são visíveis. Coloque o mestre da válvula de controle em uma resistente ao calorrecipiente, tal como um prato de vidro. Com cuidado, despeje 5: 1 PDMS relação sobre o mestre, e desgaseificar o recipiente uma segunda vez. Enquanto o recipiente PDMS válvula de controle está sendo isentos de gases spin-coat as 20: 1 PDMS relação no master membrana deitando, com cuidado a mistura PDMS para o mestre de membrana para minimizar a formação de bolhas de ar, então spin-coating o mestre a 1.000 rpm durante 45 seg. Parcialmente curar ambos mestres em um forno a 80 ° C durante 6 minutos para o mestre da membrana e 15 min para o mestre da válvula de controle. NOTA: Quando parcialmente curado, os PDMS deve manter sua forma, mas o material será um pouco brega. Se PDMS ainda não está curada, asse novamente em incrementos de alguns minutos a uma hora até que o material mantém a sua forma quando pressionado. Corte PDMS retangulares moldes de mestre válvula de controle, peeling os moldes fora suavemente. Furos de entrada de ar, através da componente moldada usando um furador 0,75 milímetros. NOTA: O buraco pode ser limpo através da inserção de um blun calibre 23t a ponta da agulha, e o exterior do molde pode ser feita com fita celofane, se necessário. Usando um microscópio óptico para localizar as câmaras de reacção sobre o mestre membrana, alinhar o componente de molde válvula de controle com as características da membrana câmara de reacção e colocar o componente de válvula de controlo directamente em cima da membrana mestre. Oriente a entrada da válvula de controle para o canto inferior esquerdo do dispositivo, e garantir que as câmaras de reação e canal do mestre membrana são visíveis no interior da válvula de controle rectangular. Coza os componentes do molde alinhadas a 80 ° C durante 2 horas. NOTA: Os moldes da válvula de membrana e controle agora serão selados juntos, e manipulado como um molde. Cortar o molde PDMS em camadas de distância do mestre membrana, descascando o molde de distância do mestre com muito cuidado para não perfurar a membrana. Perfurar orifícios de entrada e saída para a entrada do extracto celular utilizando um furador 0,75 milímetros. Faça furos através de ambas as camadas,e limpá-los na mesma maneira como descrito no passo 2.6. Usando um limpador de plasma indutivamente acoplado, deleite plasma tanto o molde (lado membrana para cima) e um No. 0 vidro lamela em 10,5 W por 20 s. Remover imediatamente a lamela e molde do limpador de plasma e camada os componentes, o lado da membrana para o vidro, tentando minimizar bolsas de ar entre o vidro eo molde. Não prima directamente no canal de entrada da membrana, ou a membrana pode emparelhar com o vidro, o que torna difícil preencher o canal com reagentes. Tome especial cuidado ao manusear os dispositivos montados para evitar a quebra da camada de vidro. Use lamelas de vidro finas como o dispositivo deve ser trabalhada através da lamela de vidro usando alta ampliação objetivos de imersão em óleo – se o vidro é muito grosso, os recursos do dispositivo podem não ser visíveis. Finalmente, os dispositivos de cura completado, a 80 ° C durante 2 horas. 3. Setup Experimental for Protein livre-Cell reação de síntese Hidratar um dispositivo por fervura em água desionizada durante 1 hora. NOTA: O aparelho deve ter uma aparência turva quando completamente hidratado. O dispositivo pode também ser deixado O / N em água estéril à temperatura ambiente para hidratar-lo. Utilizando um microscópio invertido com uma câmara de incubação, ajustar a temperatura ambiente até 30 ° C. NOTA: Esta temperatura foi escolhida para optimizar a expressão de GFP com um promotor de T7, de modo que as temperaturas óptimas para outras reacções podem variar de 40. Dispositivo Mount para microscópio titular palco com fita adesiva e enrole bordas do dispositivo com lenço de papel molhado, a fim de manter a hidratação local. Use duas em circuito fechado transdutores de pressão tensão alta precisão para modular a pressão de gás nitrogênio para acionamento da válvula de controle e entrada de reagente. NOTA: Este protocolo só foi testado com nitrogênio de baixa pureza, embora possam ser utilizados outros gases inertes. Ligue o primeiro transdutor por24 gauge tubagem de PTFE para um reservatório de água realizado em um frasco de vidro de 4 ml com uma tampa de septo. Ligue o reservatório para a entrada da válvula de controlo utilizando um segundo tubo terminado por uma ponta romba de calibre 23 de agulha. NOTA: Ambos os tubos penetrar no septo reservatório com duas afiadas 23 agulhas de calibre. Conecte o segundo transdutor por tubulação PTFE 24 de calibre conectado a um macho macho-conector Luer-lok. Anexar a um Luer-lok agulha de calibre 23 ligada a um tubo com outro calibre 23 agulha ponta romba, que é montado individualmente para cada dispositivo. Esta agulha liga-se ao canal de reacção, da membrana; usá-lo para limpar água a partir do canal de reacção, e os reagentes de entrada. Utilizando um sistema de expressão de proteína isenta de células, para montar os componentes da reacção CFPS em gelo, de acordo com as instruções do fabricante. Minimizar o tempo gasto segurando reagentes CFPS em gelo e colocar a mistura reaccional para o dispositivo imediatamente após a montagem. NOTA: Este dispositivo tem sidousado com um E. comercial coli extrair kit de expressão da proteína e um plasmídeo que expressa constitutivamente GFP. O volume total da reacção foi reduzida para 25 ul -, pode ser possível utilizar um volume menor até mesmo para os reagentes, se desejado. Como reagentes CFPS tendem a ser sensíveis a ciclos de congelação-descongelação, pode ser útil fazer alíquotas dos reagentes no volume apropriado antes da experiência. Outros reagentes podem ser adicionados à mistura de reacção, mas a reacção tem que ser completamente montado antes de ser aplicada ao dispositivo. Montar a reação, adicionando a entrada DNA passado. Observação: Uma vez montada num tubo de Eppendorf, a reacção começará CFPS se não mantida em gelo. Uma vez que o tempo necessário para aplicar os reagentes para o dispositivo e começar a experiência pode variar, é útil para iniciar um temporizador quando a reacção é montado e misturados – isto irá manter a escala de tempo entre experiências consistentes, e ajuda na solução de problemas. Usando oligador de tubagem e agulha descrito no Passo 3.4.2, retirar a reacção montados no interior do tubo utilizando uma seringa de 1 ml. Insira a agulha de ponta romba para a entrada de câmara de reação. Retire o conector da agulha da seringa e anexá-lo ao conector macho-macho utilizado para o transdutor câmara de reação. Aplicar pressão (<10 psi) para os reagentes CFPS para preencher o canal. Remover a agulha, quando a reacção está cheio. Inserir o tubo romba do outro transdutor na entrada da válvula de controlo. Não pressurizar a válvula de controle ainda. Coloque o dispositivo montado no palco. Utilizando imagens de campo claro, localizar as câmaras de reação com um objetivo de imersão em óleo 100X. Accionar a válvula de controle através da pressurização do transdutor válvula de controle para 20 psi; uma mudança visível na membrana é evidente, quando a válvula de controlo é actuada. Concentre-se no fundo das câmaras de reação. Comece a aquisição de imagens; crescimento em fluorescência wdoente ser visível no interior e em torno do exterior das câmaras de reacção, embora provavelmente não será evidente nas primeiras fases da reacção. Captar imagens a cada 1-3 minutos até que a reacção atinja um estado estacionário de fluorescência. Se um estágio com foco automaticamente não estiver disponível, reorientar brevemente cada imagem antes de as imagens que estão sendo tomadas. NOTA: Enquanto alguns fotobranqueamento vai ocorrer, os efeitos sobre a fluorescência relativa, devido a foto-branqueamento pode ser contabilizada, contanto que a taxa de fotobranqueamento é conhecido. Esta taxa de fotobranqueamento pode ser estimada através da exposição de um padrão de fluorescência, tal como uma concentração conhecida de GFP ou uma mistura fluoróforo, a fotobranqueamento constante ao longo de um período de tempo. Anote o tempo decorrido a partir da montagem de reação para a primeira imagem adquirida. NOTA: Isso normalmente leva 4-5 min. Análise 4. Imagem e Processamento de Dados Usando um software de análise de imagens, como o ImageJ, selecione ointerior das câmaras de reacção como uma ROI. Adquirir o valor de intensidade de fluorescência média do ROI para todas as imagens. NOTA: Este é o traço intensidade de fluorescência em bruto. Executar esta tarefa no ImageJ usando os plugins Time Series Analyzer e ROI Gestor – Use Time Series Analyzer a escolher as regiões de interesse em torno do interior de cada câmara de reação. Defina "AutoROIProperties" para uma área que corresponde ao interior de cada câmara de reação, marque a opção "Add On Click" e selecione cada uma das câmaras. Nota: Esta etapa também pode ser feito usando a ferramenta elipse para desenhar um ROI em torno da câmara fluorescente. Este tamanho do ROI geralmente corresponde a uma elipse 30 x 30 pixel para uma câmara de 10 um de diâmetro com um objectivo viram 100X. Realce todos os ROIs no Gerenciador de ROI. Use a função "Multi Medida" para determinar a média da intensidade de fluorescência de cada ROI através de toda a pilha de imagens. NOTA: Um plugin chamado StackReg pode ser usada para alinhar a pilha de imagens, se necessário. Depois de adquirir os vestígios de intensidade de fluorescência em bruto para todas as câmaras de uma experiência, determinar o componente determinista da reacção utilizando uma média inter-experimental em todos os vestígios, e subtraindo a média dos vestígios de matérias individuais. Use um software de análise de dados, tais como IGOR ou MS Excel para esta análise. NOTA: Este fornece ruído traça para cada câmara de reação. Analisar o ruído de expressão do gene a partir destas câmaras de reacção, utilizando os mesmos métodos utilizados para analisar a expressão do gene de ruído derivada a partir de células 25.

Representative Results

A vantagem distinta desta plataforma microfabricado está na aplicação da "válvula de controlo" elastomérico controlável que é accionado de forma independente, a fim de limitar as reacções CFPS (Figura 2A). Quando o dispositivo é accionado, as câmaras de membrana são pressionadas contra a lâmina de vidro para confinar reagentes fluorescentes em uma matriz de câmaras de reacção (Figura 2C). A fim de verificar que as câmaras de confinar a reacção de forma fiável através da duração da experiência, uma base FRAP (Recuperação de fluorescência Após fotodegradação) teste foi realizado 37. Um fluoróforo (AF 555) foi aplicada ao dispositivo, e a válvula de controlo foi accionado; utilizando a abertura do obturador do microscópio, num único poço confinando o fluoróforo foi isolado e Foto-descoloração individualmente (Figura 2D). O escolhido bem tornou-se escuro e não se recuperou em brilho até que a válvula de controle foi despressurizado 20 min60; depois, libertando a câmara a partir do vidro. Este teste verifica-se que estas câmaras de reacção permanecer bem fechado durante a duração da experiência. Em condições óptimas, a reacção CFPS expressar uma proteína facilmente visualizado (tais como GFP ou luciferase) expressa a proteína detectável dentro de poucos minutos de ser aplicado a este dispositivo. Ao longo da duração da reacção, a síntese de proteínas no interior e exterior das câmaras de reacção é representada por imagem e quantificada por unidades de medição da intensidade de fluorescência dentro de cada câmara (Figura 3A). A intensidade de fluorescência, que corresponde a concentração de proteína, pode ser mapeado ao longo do tempo para cada câmara de reacção (Figura 3D). A expressão dos genes é um processo inerentemente estocástica que introduz flutuações (ruído) a cada passo molecular (síntese, degradação, proteína-DNA de ligação, etc.) 20. Um ramo da biologia ruído centra-se nao valor probatório do gene ruído do circuito 41. A expressão em sistemas isentos de células terá efeitos do ruído extrínsecos que surgem de interacções entre a maquinaria molecular de expressão e as superfícies que definem os limites dos vasos de reacção. Estes efeitos extrínsecos provavelmente vai se tornar mais pronunciado como reações de células livres estão confinados em câmaras de reação ainda menores. A capacidade de executar time-lapse de imagens de múltiplas reações CFPS confinados, então, permite a análise cuidadosa da estrutura de ruído (magnitude e dinâmica) em sistemas livres de células confinadas em uma forma directamente análoga a métodos que têm sido relatados para sistemas celulares 25. Figura 3C e 3D mostram a evolução temporal de expressão da GFP constitutivo de um promotor de T7 num padrão de 384 poços de microplacas com um volume de 15 ul bem, em comparação com PDMS em câmaras de reacção de 10 um de diâmetro, correspondendo aos volumes de apenas cerca de 300 fl, sobre ordem de setes de magnitude menos. A variabilidade nas taxas de expressão de proteínas nas câmaras de reacção de 10 mm é muito mais elevada do que nas medições bem-placa, aproximando-se aos observados em células. Multiplexados reacções realizadas no dispositivo apresentar cinética semelhante ao CFPS reacções realizadas em grandes quantidades, num leitor de microplacas (Figura 3B), onde há um rápido aumento na fluorescência que planaltos, geralmente aceite que é causada por uma limitação de recurso no interior do volume de reacção 42,43 . Este comportamento de crescimento determinista, embora flutuante, é geralmente consistente em todas as câmaras de reacção, e entre experiências – fazendo a média entre as câmaras de vestígios de experimentos, a tendência determinista pode ser subtraído a partir de valores de rastreamento, deixando apenas os componentes de ruído da reacção (Figura 4A) . A Figura 4B mostra a expressão da GFP ruído após a remoção do, componente transiente determinista (topo), E a autocorrelação de ruído (parte inferior), enquanto que a figura 4A mostra os traços correspondentes nas câmaras de reacção de 10 ^ m. A distribuição dos tempos de meia-os vestígios de autocorrelação dá a dependência da frequência do ruído, enquanto o atraso de tempo zero os vestígios de autocorrelação dá as magnitudes do ruído, tal como a variância. Figura 1. reagentes síntese da proteína-Free Cell são confinados em câmaras de reação escala femtoliter com a finalidade de medir a expressão do gene de ruído. Reagentes de um sistema de expressão de proteína livre de células comercial são usados ​​para constitutivamente expressa GFP dentro confinado câmaras de reação PDMS. Uma matriz destas câmaras podem ser visualizados com microscopia de fluorescência de lapso de tempo, a fim de caracterizar a expressão de proteínas e expressão gênica de ruído. A intensidade de fluorescência of cada câmara de reação ao longo do tempo podem ser plotados como um traço individual. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2. Fabricação de duas camadas dispositivo micro com câmaras lacrado femtoliter escala. (A) Layout e vista explodida das camadas do dispositivo. O dispositivo é composto por duas camadas de PDMS e uma lamela de vidro. A membrana de PDMS, selado entre as camadas de vidro e de válvulas de controlo, mantém as câmaras de reacção. (B) imagem SEM de PDMS câmara de reação. O diâmetro interior é de 10 um. (C) Esquema de canais de entrada no dispositivo. Proteína-Free Cell Synthesis (CFPS) reagentes são transportados através do canal de reação. A água é pressurizada no controleválvula para comprimir as câmaras de reação contra a lâmina de vidro, selando as câmaras 37. Reproduzido de Ref. 37 com a permissão da The Royal Society of Chemistry. (D) recuperação de fluorescência Após Fotodegradação de teste (FRAP) em um único poço, utilizando FITC indica câmara é bem vedado contra ambiente externo. O fluorophore foi capturado nas câmaras (imagem superior) e um único poço foi Foto-descoloração (imagem inferior). Nenhuma recuperação de fluorescência foi visto na câmara Foto-descoloração até que a válvula de controle foi lançado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3. EGFP Expressão em Confinado Reaction-Free Cell. (A) As imagens de fluorescência de selado reação c Hambers em pontos de tempo escolhido na reacção. Produção de proteínas pode ser visto tanto no interior das câmaras de reacção e fora das câmaras do canal principal. (B) EGFP foi clonado num vector pET3a, proporcionando um promotor de polimerase de T7 e terminador e um local de ligação ao ribossoma forte (RBS). (C) As medições de fluorescência normalizados de expressão constitutiva de EGFP em uma reacção isento de células grandes quantidades realizada num leitor de microplacas. Reações CFPS costumam produzir proteína rapidamente, antes de desacelerar para uma fluorescência "estado estacionário" – esta está associada a limitação de recursos 43. Traços pretos indicam o traço médio. (D) fluorescência normalizada de 51 vestígios de intensidade de fluorescência a partir de matérias-li 51 câmaras de reacção ao longo de várias experiências. Traços pretos indicam o traço média ao longo de várias experiências, que ilustram o componente determinístico da expressão da proteína."Target =" _ /52616/52616fig3large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4. Traços de ruído individuais e Noise Autocorrelation de um sistema celular e-Free Cell. (A) A partir de Austin et al., 2006. O ruído na expressão GFP (topo) e funções de autocorrelação normalizados (em baixo) adquiridos de rastreio da produção GFP em bactérias vivendo 25. Reproduzido com permissão da Macmillan Publishers Ltd: [Nature] 25 (Vol. 439), de direitos de autor (2006). (B) O ruído na expressão GFP (topo) e funções de autocorrelação normalizados (em baixo) adquiridos de produção GFP em sistema livre de células, rastreados em câmaras de reação dispositivo microfluídicos. Por favor clique aquipara ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A expressão de genes em células é inerentemente barulhento devido a pequenos volumes celulares e baixos números de cópias de reagentes importantes. Biologia Noise muitas vezes concentra-se nas fontes, processamento e conseqüências biológicas de flutuações nas populações, concentrações, posições, ou estados de moléculas que controlam circuitos de genes e redes 44. A grande maioria deste trabalho foi executado em sistemas celulares, o que tem a vantagem de exibir o ruído de um circuito de genes dentro do contexto natural das redes genéticas dentro da célula. No entanto, os sistemas isentos de células permitem a caracterização das flutuações intrínsecas de um circuito individual do gene sem os efeitos extrínsecos confusão 18 que não podem ser evitadas em sistemas celulares. Análise de ruído pode oferecer importantes percepções físicas em como genética circuitos são estruturados e como eles funcionam, e tem sido usado em sistemas celulares para caracterizar negativo e 25 positivo <sup> 27 de autoregulação, extrínsecos e intrínsecos contribuições ao ruído expressão 18, e transcrição estourando 45,46. Aqui descrevemos o estudo de um sistema de expressão isento de células em microcanais que permitem o controlo simultâneo de tamanho de reactor e de iniciação da reacção de vezes, a fim de melhor compreender o papel que o confinamento e aglomerando 47,48 têm em intrínseca de ruído sem a expressão da proteína complicações associadas com células vivas.

A chave permitindo característica do projeto é a integração de matrizes de femtoliter volume (micro-escala) câmaras de reação utilizados para confinar os reagentes de um sistema de expressão de proteína livre de células, com uma membrana elastomérica "válvula de controle" em PDMS que intercepta o reagentes a uma estrutura bem definida, "tempo zero" para iniciação da reacção (Figura 1). Este controlo permite que a cinética das reacções envolvidas na síntese da proteína a ser exerdevidos em tempo real com alta precisão. Como tal, é importante gerir reagentes isentos de células, de modo que a variabilidade inter-experimental é minimizado tanto quanto possível. Este controlo permite-nos avaliar a estrutura dos circuitos de ruído genéticos livre de células de forma que é análoga às técnicas anteriormente usadas para avaliar a expressão do gene em células vivas.

Como reagentes utilizados em sistemas CFPS podem ser sensíveis a ciclos de congelação-descongelação, é importante para manter os reagentes frio e minimizar o tempo que os reagentes passam descongelar em gelo. É uma boa prática para testar periodicamente o sistema de expressão do CFPS em grandes quantidades, a fim de identificar as alterações nos níveis de expressão ao longo do tempo – isto pode ser feito em uma reacção de 10-15 ul num tubo de Eppendorf, ou em um dispositivo como um leitor de microplacas , que realiza várias leituras ao longo do tempo para capturar cinética de reação. Observando os tempos de idade e descongelamento dos reagentes para cada experimento vai ajudar ao solucionar baixa expressão levels. Além disso, quando se monta reagentes CFPS, é importante notar que a reacção irá começar uma vez que é totalmente montada e removida do gelo. A fim de manter um "tempo zero" consistente, é útil para gravar o tempo após o início da reacção CFPS após a adição final do ADN de entrada, e para aplicar a reacção tão rapidamente quanto possível para o dispositivo incubadas. Este processo deve levar cerca de 4-5 min, e fluorescência ainda não deve ser visível dentro das câmaras de reação. Esse controlo garante que o tempo disponível para a visualização da porção crescimento da curva da reacção é maximizada.

Antes de executar reações CFPS no dispositivo, é aconselhável para executar testes de controle de qualidade para verificar que não haja vazamento das câmaras. Um teste de FRAP pode ser realizada (como na Figura 2D) através da aplicação de um fluoróforo para o dispositivo e expondo uma cavidade individual até que o poço é completamente branqueada. Se as câmaras sãobem fechados, sem a recuperação deve ser visível no interior do poço – deve haver um grande contraste entre as paredes do compartimento e os espaços interiores e exteriores. Se a recuperação de fluorescência é aparente ou as paredes da câmara de reacção não são bem definidas, a pressão sobre a válvula de controlo pode ser aumentado ou o dispositivo deve ser marcada para detecção de fugas ou delaminação da lâmina de vidro.

Este protocolo foi testado com os reagentes a partir de uma E. CFPS comercial Kit coli isento de células de expressão da proteína (escala para 25 ul), embora outros sistemas CFPS robusto pode ser utilizado. É possível utilizar quantidades muito menores do que 25 jil quando se aplica a reacções do dispositivo, o que pode ser útil quando o custo do reagente é um factor limitante em experimentos. Uma vez que os reagentes são adicionados ao dispositivo e as câmaras de reacção são seladas, não é possível adicionar reagentes para a solução sem a válvula de comando de accionamento de – assim, este dispositivo não é suitable para reacções que requerem a adição de reagentes durante o decurso da reacção. Este dispositivo também não é optimizada para observar as reacções CFPS que pode executar mais do que 3 horas – os efeitos de desidratação e de secagem do aparelho após este período de tempo não foram avaliadas. Se os tempos de reacção mais longos são desejados, estes efeitos podem ser mitigados por meio de selagem do dispositivo para evitar a evaporação, mudando a temperatura de incubação, ou utilizando uma câmara de humidade. As alterações ao projecto dispositivo, tais como estruturas nanoporosos nas paredes da câmara de 49,50 ou a inclusão de uma camada de membrana porosa, representar alguns métodos que podem permitir a troca de reagentes e, assim, alongar prazos de reacção.

Compartimentos de reação microfabricados de volume de uniforme são valiosos para a manutenção de dimensões consistentes em experimentos e altamente adequado para investigação das "reações colaterais" com as paredes do compartimento. Ao contrário dos métodos que não utilizam nenhumtécnicas de n-microfabricados, essas reações devem ser avaliadas em pequenas quantidades, e não fornecem flexibilidade dimensional durante as experiências. No entanto, o desenho controlável para estas câmaras de reacção é altamente apropriado para a microscopia de lapso de tempo, e pode ser um complemento de iluminação para um método de alto rendimento de confinamento.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. Mitch Doktycz, Dr. Jennifer Morrel-Falvey, Dr. Amber Bible, and Dr. Brandon Razooky for helpful advice and conversations, and acknowledge Dr. Sukanya Iyer for constructing the Pet3a-EGFP plasmid used in the gene expression tests. We acknowledge support from the Center for Nanophase Materials Sciences, which is sponsored by the Scientific User Facilities Division, Office of Science, U.S. Department of Energy. SEN and PMC acknowledge support from Bredesen Center Fellowships at the University of Tennessee, Knoxville. This research was performed at Oak Ridge National Laboratory (ORNL). ORNL is managed by UT-Battelle, LLC, for the U.S. Department of Energy.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
SU-8 2015 Microchem SU-8 2000 series Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
SU-8 Thinner Microchem SU-8 2000 series Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
SU-8 Developer Microchem SU-8 2000 series Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
Chlorotrimethylsilane Sigma Aldrich 92360 FLUKA Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water.
Sylgard 184 PDMS Dow Corning SYLGARD 184
0.75 mm hole-puncher Ted Pella Inc. 15072 Harris Uni-Core
23 ga needles blunt tip Component Supply Co. /NE-231PL-25
#0 glass coverslip Ted Pella Inc. 260366 Gold Seal
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001
Microscope Nikon Instruments Eclipse TE 300
CCD camera Roper Scientific CoolSNAP-HQ
Shutter Shutter Insturment Lambda SC
Light Source Nikon Intensilight C-HGFI
Color Filters Chroma Technology Corp. ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission
100x oil-immersion objective Nikon N.A. 1.4
Temperature Regulator Oko Lab H201-T
Metamorph Universal Imaging Corp. Version 7.8.3.0
Marsh Bellofram transducers Marsh Bellofram T2000
24 gauge PTFE tubing Component Supply Co. /SWTT-24-C
Septum vials National Scientific C4015- 17W
Power Supply Hewlett Packard 6205B Dual DC Power Supply
sharp 23 ga needles Precision Glide 305129
Male-to-male luer lock adapters Qosina 20024 Polycarbonate
Stainless Steel Blunt Needle 23 Ga. Component Supply Co. /NE-232PL-5C Polypropylene
S30 E coli protein expression system Promega L1110
Pet3a-GFP vector/protein Novagen 69418-3 Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a.
Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit Biorad #732-6120
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Alexafluor 555 Molecular Probes AF555 http://www.lifetechnologies.com
ImageJ National Institutes of Health Version 1.46r
Plugin: Time Series Analyzer Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA Version 3.0
Plugin: StackReg/TurboReg Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne Biomedical Imaging Group Distribution is dated July 7, 2011
Plugin: ROI Manager Tools Tiago Ferreira 12/15/2013 Version
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Klammt, C., et al. High level cell-free expression and specific labeling of integral membrane proteins. European Journal of Biochemistry. 271, 568-580 (2004).
  2. Wong, R. W., Blobel, G. Cohesin subunit SMC1 associates with mitotic microtubules at the spindle pole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 15441-15445 (2008).
  3. Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 15985-15990 (2013).
  4. Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS synthetic biology. 1, 408-413 (2012).
  5. Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
  6. Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and cellular biology. 14, 7322-7330 (1994).
  7. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of visualized experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
  8. Karig, D. K., Jung, S. -. Y., Srijanto, B., Collier, C. P., Simpson, M. L. Probing cell-free gene expression noise in femtoliter volumes. ACS synthetic biology. 2, 497-505 (2013).
  9. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS synthetic biology. 1, 29-41 (2012).
  10. Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345, 829-832 (2014).
  11. Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production – a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and bioengineering. 108, 1570-1578 (2011).
  12. Kato, A., Yanagisawa, M., Sato, Y. T., Fujiwara, K., Yoshikawa, K. Cell-Sized confinement in microspheres accelerates the reaction of gene expression. Scientific reports. 2, 283 (2012).
  13. Simpson, M. L., Sayler, G. S., Fleming, J. T., Applegate, B. Whole-cell biocomputing. Trends in biotechnology. 19, 317-323 (2001).
  14. Korobkova, E., Emonet, T., Vilar, J. M., Shimizu, T. S., Cluzel, P. From molecular noise to behavioural variability in a single bacterium. Nature. 428, 574-578 (2004).
  15. Weinberger, L. S., Burnett, J. C., Toettcher, J. E., Arkin, A. P., Schaffer, D. V. Stochastic gene expression in a lentiviral positive-feedback loop: HIV-1 Tat fluctuations drive phenotypic diversity. Cell. 122, 169-182 (2005).
  16. Arkin, A., Ross, J., McAdams, H. H. Stochastic kinetic analysis of developmental pathway bifurcation in phage λ-infected Escherichia coli cells. Genetik. 149, 1633-1648 (1998).
  17. Kulkarni, R. P., Dworkin, J., Garcia-Ojalvo, J., Elowitz, M. B. Tunability and noise dependence in differentiation dynamics. Science. 315, 1716-1719 (2007).
  18. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
  19. McAdams, H. H., Arkin, A. Stochastic mechanisms in gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 814-819 (1997).
  20. Elston, T. C., Blake, W. J., Collins, J. J. Stochasticity in gene expression: from theories to phenotypes. Nature Reviews Genetics. 6, 451-464 (2005).
  21. Blake, W. J., Kærn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. Noise in eukaryotic gene expression. Nature. 422, 633-637 (2003).
  22. Rao, C. V., Wolf, D. M., Arkin, A. P. Control, exploitation and tolerance of intracellular noise. Nature. 420, 231-237 (2002).
  23. Raj, A., van Oudenaarden, A. Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences. Cell. 135, 216-226 (2008).
  24. Pedraza, J. M., van Oudenaarden, A. Noise propagation in gene networks. Science. 307, 1965-1969 (2005).
  25. Austin, D., et al. Gene network shaping of inherent noise spectra. Nature. 439, 608-611 (2006).
  26. Simpson, M. L., Cox, C. D., Sayler, G. S. Frequency domain analysis of noise in autoregulated gene circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 4551-4556 (2003).
  27. Weinberger, L. S., Dar, R. D., Simpson, M. L. Transient-mediated fate determination in a transcriptional circuit of HIV. Nature genetics. 40, 466-470 (2008).
  28. Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7, 383-392 (2009).
  29. Nourian, Z., Danelon, C. Linking genotype and phenotype in protein synthesizing liposomes with external supply of resources. ACS synthetic biology. 2, 186-193 (2013).
  30. Pereira de Souza, T., Stano, P., Luisi, P. L. The minimal size of liposome-based model cells brings about a remarkably enhanced entrapment and protein synthesis. ChemBioChem. 10, 1056-1063 (2009).
  31. Nomura, S. i. M., et al. Gene expression within cell-sized lipid vesicles. ChemBioChem. 4, 1172-1175 (2003).
  32. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).
  33. Park, N., Um, S. H., Funabashi, H., Xu, J., Luo, D. A cell-free protein-producing gel. Nature. 8, 432-437 (2009).
  34. Swaay, D., deMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab on a Chip. 13, 752-767 (2013).
  35. Okano, T., Matsuura, T., Kazuta, Y., Suzuki, H., Yomo, T. Cell-free protein synthesis from a single copy of DNA in a glass microchamber. Lab on a Chip. 12, 2704-2711 (2012).
  36. Ito, T., Okazaki, S. Pushing the limits of lithography. Nature. 406, 1027-1031 (2000).
  37. Fowlkes, J. D., Collier, C. P. Single-molecule mobility in confined and crowded femtolitre chambers. Lab on a Chip. 13, 877-885 (2013).
  38. Herold, K. E., Rasooly, A. . Lab on a Chip Technology: Biomolecular separation and analysis. 2, (2009).
  39. Unger, M. A., Chou, H. -. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
  40. Karig, D. K., Iyer, S., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Expression optimization and synthetic gene networks in cell-free systems. Nucleic acids research. 40, 3763-3774 (2012).
  41. Cox, C. D., McCollum, J. M., Allen, M. S., Dar, R. D., Simpson, M. L. Using noise to probe and characterize gene circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 10809-10814 (2008).
  42. Siegal-Gaskins, D., Noireaux, V., Murray, R. M. . American Control Conference (ACC), 2013. , 1531-1536 (2013).
  43. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Substrate replenishment extends protein synthesis with an in vitro translation system designed to mimic the cytoplasm). Biotechnology and bioengineering. 87, 465-471 (2004).
  44. Simpson, M. L., et al. Noise in biological circuits. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 1, 214-225 (2009).
  45. Dar, R. D., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 17454-17459 (2012).
  46. So, L. -. h., et al. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nature genetics. 43, 554-560 (2011).
  47. Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., LeDuc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nat Nano. 8, 602-608 (2013).
  48. Sokolova, E., et al. Enhanced transcription rates in membrane-free protocells formed by coacervation of cell lysate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 11692-11697 (2013).
  49. Retterer, S. T., Siuti, P., Choi, C. -. K., Thomas, D. K., Doktycz, M. J. Development and fabrication of nanoporous silicon-based bioreactors within a microfluidic chip. Lab on a Chip. 10, 1174-1181 (2010).
  50. Siuti, P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. Continuous protein production in nanoporous, picolitre volume containers. Lab Chip. 11, 3523-3529 (2011).

Tags

Cell-free BiologyFemtoliter ChambersPDMS DeviceCell-free Protein SynthesisReaction KineticsGene CircuitsNoise Biology

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Norred, S. E., Caveney, P. M., Retterer, S. T., Boreyko, J. B., Fowlkes, J. D., Collier, C. P., Simpson, M. L. Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology. J. Vis. Exp. (97), e52616, doi:10.3791/52616 (2015).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image