無細胞生物学のための密封可能なフェムトリットル商工配列

デバイスのマスターズの1。光リソグラフィ少なくとも1時間〜250℃のホットプレート上に清浄なシリコンウェーハを脱水する。 注：それはマスターを準備する際、ユーザー·エラーの場合には、複数のウェハを使用することをお勧めします。 フォトレジストアリコートを準備します。 SU-8希釈剤としてシンナーを使用して1：1の比SU-8 2015レジスト及び2におけるSU-8 2015フォトレジストの希釈の両方のアリコートを準備します。 注：約1ミリリットルのフォトレジストをスピンコーティングする一枚のウェハのために必要とされる。 これらのマスターを製造するための3のマスクパターンを準備します。 1パターニング膜チャネルおよび他のパターニングの反応室：膜マスターのために、二つのマスクを準備します。コントロールバルブのマスターのために、一つだけのマスクパターンを用意。 注：マスクパターニングを含むリソグラフィ技術、の詳細については、デバイス設計のより詳細な説明については、伊藤と岡崎、2000年36参照Fowlkesとコリアー、2013を参照してください37。 メンブレンマスターを準備スピンコート2：45秒、1,000 rpmでウェーハ上の1 SU-8 2015レジスト希釈。 2分間95℃でソフトベークウェハ。コンタクトアライナーを使用して、10秒間、膜チャネルパターンを有するウェハを露出し、95℃で2分間、露光後ベークを行う。 1分間のSU-8現像液中でのウエハの開発、​​またはフォトレジスト残渣が除去されるまで。上から下に移動し、イソプロパノールでウェハをすすぐ。窒素で乾燥したウエハは、再び、上から下に移動する。 4分間180℃でベークウェハ。 45秒間、2000rpmで1 SU-8の希釈：スピンコートは2で再びウェーハをパターン化。 ソフトベークは、95℃で2分間、ウェハをパターン化。コンタクトアライナーを使用して、反応室パターンでパターン化されたウェハを合わせ、10秒間露光する。 95℃で2分間、露光後ベークを行う。 ステップ1.4.3で説明したようにウェーハを開発する。ウエハを現像し、乾燥した後、4分間180℃でベークウェハ。 NOTE：ウエハは、前のステップで使用したのと同じ現像液で現像することができる。 コントロールバルブマスターを準備スピンコートは、45秒間、2000rpmでクリーンなウエハ上にSU-8フォトレジストを原液。 6分間95℃でソフトベークウェハ。コンタクトアライナーを使用して、10秒間の制御弁パターンでウエハを露光する。 6分間95℃で露光後ベークを行う。 2分間のSU-8 Developerでウエハーを開発し、または残基が除去されるまで。上から下に移動し、イソプロパノールで洗浄します。 4分間180℃で窒素ベークによるドライウェハ。 2. PDMSデバイスの製造蒸着によって〜0.2ミリリットルトリメチルクロロ持つすべてのマスターをSilanize。 すばやくシラン化剤を数滴RTで密閉容器にマスターを囲みます。 注：他のシラン化プロトコルは許容できる38場合に実行properl。yは、PDMSは除去するのが容易になります。 同様の多層弁で実証されているように39を設計し 、デバイスの膜及びコントロールバルブ層の両方のために異なる比率で商用ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）ベースと硬化剤を混合する。 1と5：1の塩基の比率：20を使用して膜および制御弁モールドのための硬化剤を、それぞれ。 メンブレン型の場合は、硬化剤を0.5gと塩基10gを混合する。 注：このボリュームはメンブレンマスター上にスピンコートになります。 1：1の比コントロールバルブモールドの場合は、5でベー​​スと硬化剤を混ぜる。制御弁を成形するのに必要なPDMSの量は、制御弁のマスタを保持するために使用されるコンテナに依存するであろう。マスターは、PDMSの〜1センチメートルで被覆されているような容器を満たす。 気泡が見えなくなるまで徹底的に真空チャンバー内に両方PDMSの準備、そして脱ガスそれらをミックス。耐熱性に制御弁マスタを配置容器、ガラス皿など。 1の比率でマスター上PDMS、および脱ガス容器の二回目：慎重5を注ぐ。 制御弁PDMS容器は脱気されている間に、スピンコートは20：慎重に気泡の発生を最小限に抑えるために、膜のマスターの上にPDMS混合物を注ぐことにより、膜マスターの1比のPDMSは、その後スピンコートマスターを1000rpmで45秒間。 部分的に膜マスター制御弁マスタ15分間、6分間80℃のオーブン中で両方のマスターを治す。 注：部分的に硬化すると、PDMSは、その形状を保持する必要がありますが、材料がわずかに粘着性になります。 PDMSがまだ硬化していない場合は押されたときに、材料がその形を保持するまで、一度に数分刻みで再び焼く。 そっと離れて金型を剥離、制御弁マスターから長方形のPDMSモールドをカット。 0.75ミリメートル穴パンチを用いて成形コンポーネントを介して注入口の穴をパンチ。 注：穴23ゲージblunを挿入することにより洗浄することができる必要であれば、tの先端針、金型外部は、セロハンテープで洗浄してもよい。 膜マスターに反応チャンバを配置すること、光学顕微鏡を用いて、反応室の膜の機能を制御弁モールド部品を整列し、膜のマスターの上に直接コントロールバルブコンポーネントを配置。オリエントデバイスの左下隅に制御弁入口、および膜マスターの反応室とチャンネルが長方形のコントロールバルブの内側に表示されていることを確認してください。 2時間80℃で整列モールド部品を焼く。 注：膜および制御バルブの型は今一緒に密封し、1モールドとして操作される。 膜を穿孔しないように、非常に静かにマスターから金型を剥離し、離れて膜マスターから層状のPDMSモールドをカット。 入口パンチ0.75 mmのパンチを使用して細胞抽出入力の穴出口。両方の層を通って穴を開け、ステップ2.6で説明したのと同じ方法でそれらを清掃してください。 誘導結合プラズマクリーナー、プラズマ御馳走両方の型（膜面上）と20秒間10.5 Wで0号カバーガラスを使用した。直ちにプラズマクリーナーからカバースリップやカビを除去し、ガラスと金型との間のエアポケットを最小限にしようとすると、ガラスに向かって、膜側のコンポーネントを層。メンブレン入力チャネルに直接押さないでください、または膜が困難反応物質とのチャネルを埋めるために作り、ガラスにアニールすることができる。 ガラス層を破損しないように組み立て、部品の取り扱いには特に注意してください。デバイスは高倍率油浸対物レンズを使用してガラスカバースリップを通して画像形成されなければならないような薄いカバーガラスを使用する – ガラスが厚すぎると、デバイスの機能が表示されない場合があります。 最後に、2時間80℃で完了したデバイスを硬化させる。 3.実験のセットアップFOrは無細胞タンパク質合成反応 1時間脱イオン水中で煮沸することによりデバイスを水和。 注：完全に水和した場合、デバイスは曇った外観を持つ必要があります。デバイスはまた、それを水和させるために、室温で滅菌水にO / Nを残すことができる。 インキュベーションチャンバーを倒立顕微鏡を用いて、30℃の周囲温度を設定する。 注：この温度は、そのように他の反応のための最適温度は40を変えることができる、T7プロモーターでGFPの発現を最適化するように選択した。 マウントデバイスは、セロハンテープでステージホルダーを顕微鏡及びローカル水和を維持するために、湿ったティッシュペーパーによるデバイスの縁をラップする。 制御弁の作動および試薬入力の窒素ガス圧を調節するために二つの高精度の閉ループ電圧圧力変換器を使用する。 注：他の不活性ガスを用いてもよいが、このプロトコルは、低純度の窒素でテストされている。 によって最初にトランスデューサを接続しますセプタムの蓋、4 mlのガラスバイアル中に保持された貯水槽に24ゲージのPTFEチューブ。 23ゲージの鈍先端針によって終了第二のチューブを使用して制御弁入口にリザーバを接続します。 注：両方のチューブが2鋭い23ゲージの針を持つ貯留隔壁を貫通している。 オス – オスルアーロックコネクタに接続された24ゲージのPTFEチューブにより、第2の変換器を接続します。デバイスごとに個別に組み立てられた別の23ゲージ鈍先端針とチューブで接続されたルアーロック23ゲージの針にこれを取り付けます。この針は、膜反応流路に接続する。反応チャネル、入力試薬から水をフラッシュするために使用する。 無細胞タンパク質発現系を用いて、製造業者の説明書に従って、氷上でCFPS反応のために部品を組み立てる。氷上でCFPS試薬を保持費やす時間を最小限にし、組み立てた直後にデバイスに反応を配置。 注：このデバイスは、されている商用Eで使用大腸菌タンパク質発現キットおよび構成的にGFPを発現するプラスミドを抽出する。総反応容量は25μlにスケーリングされた – それは、所望であれば、反応物のためのさらに低いボリュームを使用することも可能である。 CFPS試薬は、サイクルの凍結融解に敏感である傾向があるように、実験の前に、適切な音量での試薬のアリコートを行うことが有用であろう。他の試薬を反応混合物に添加してもよいが、反応が完全にデバイスに適用される前に組み立てる必要があります。 最後のDNA入力を追加し、反応を組み立てます。 注：エッペンドルフチュー​​ブで組み立てた後、氷上に保持されていない場合には、CFPS反応が開始されます。デバイスに試薬を適用し、実験を開始するのにかかる時間は変更される場合がありますので、反応が組み立てられ、混合された後、タイマーをスタートすることが有用である – これは、一貫性の実験、およびトラブルシューティングを支援間のタイムスケールを維持します。 使い方ステップ3.4.2で説明したチューブと針コネクタ、1mlシリンジを使用してチューブに組み立て反応を引き出す。反応室入口に鈍先端針を挿入します。注射器から針コネクタを外し、反応室トランスデューサに使用するオス – オスコネクタに取り付けます。 チャンネルを埋めるためにCFPS反応物質に圧力（<10 PSI）を適用します。反応が満たされたとき、針を外します。 制御弁入口に他のトランスデューサから鈍いチューブを挿入します。まだ制御弁を加圧しないでください。 ステージ上に搭載デバイスを配置します。明視野イメージングを使用して、100X油浸対物レンズとの反応チャンバを見つける。 アクチュエ20 psiまで制御弁トランスデューサを加圧することにより制御弁。制御弁が作動すると、膜中の目に見える変化は明らかであろう。反応チャンバーの底部に焦点を当てる。 画像取得を開始します。蛍光の成長のwそれは可能性が高い反応の初期段階では明らかではないでしょうが、病気、内部に、反応室の外側の周りに見えるように。反応が定常​​状態の蛍光に達するまで、すべての1-3分の画像をキャプチャします。自動的にフォーカスステージが使用できない場合は、簡単に画像が撮影される前に各画像をリフォーカスする。 注：いくつかの光退色が発生しますが、原因退色に対する相対蛍光の影響は限り光退色の速度が知られているように会計処理することがあります。この光退色率は、ある期間にわたって一定の光退色に、そのようなGFPの既知の濃度またはフルオロフォアの混合物のような蛍光標準を露光することによって推定することができる。 取得された第1の画像に反応アセンブリからの経過時間を記録します。 注：これは一般的に4〜5分かかります。 4.画像解析とデータ処理そのようなImageJのような画像解析ソフトウェアを使用して、選択しROIとして反応チャンバの内部。全画像のROIの平均蛍光強度値を取得する。 注：これは生の蛍光強度トレースです。 各反応室の内部の周りの関心領域を選択するために使用して時系列分析装置 – 時系列アナライザとROIマネージャープラグインを使用して、ImageJので次の作業を行います。 、各反応室の内部に対応する領域に「AutoROIPropertiesの「設定」をクリックで追加」をチェックし、各チャンバを選択します。 注：このステップは、蛍光室の周りにROIを描画する楕円ツールを使用して行うことができる。このROIのサイズは通常100X目的で閲覧直径10μm室用の30×30ピクセルの楕円に対応している。 ROIマネージャですべてのROIを強調表示します。全体画像スタックを通して各ROIの蛍光強度の平均値を決定するために、「マルチメジャー」機能を使用してください。 注：STAという名前のプラグインckRegは、必要に応じて、画像スタックを整列させるために使用することができる。 実験中のすべての室の生の蛍光強度のトレースを取得した後、すべてのトレース間での相互実験的平均を取ること、そして個々の生の痕跡から平均値を減算することにより反応の決定論的構成要素を決定する。この分析のためにそのようなIGORやMS Excelなどのデータ解析ソフトウェアを使用してください。 注：これは各反応室用のノイズトレースを提供します。 セル25から誘導された遺伝子発現のノイズを解析するために使用したのと同じ方法を使用して、これらの反応チャンバからの遺伝子発現のノイズを解析する。