密封飞升商会阵列的无细胞生物学

对设备大师1.光刻脱水的热板上干净的硅晶片，在〜250℃下进行至少1小时。 注：这是准备一个高手，如果用户错误时使用一个以上晶圆很好的做法。 准备光刻胶等分。准备两个SU-8 2015抗蚀剂和稀释的SU-8 2015抗蚀剂在2的等分试样：1的比例用SU-8稀释剂作为稀释剂。 注释：大约需要为旋涂一个晶片1毫升光致抗蚀剂。 准备三道光罩图案用于生产这些大师。对于膜万事达，准备两个掩模：1图案形成膜通道和其他图案化的反应室。对于控制阀的主，备只有一个光罩图案。 注意：有关的光刻技术的更多细节，包括掩模图案化，参见伊藤和冈崎，2000。36见Fowlkes和科利尔，2013为器件设计的更详细的描述37。 制备膜主旋涂2：1的SU-8 2015抗蚀剂稀释在晶片上以1000rpm进行45秒。 软烘烤晶片在95℃下2分钟。使用接触对准器，露出晶片膜通道模式下10秒，并在95℃下进行曝光后烘烤2分钟。 开发晶片中的SU-8显影剂1分钟，或直至光刻胶残留物去除。晶圆清洗用异丙醇，从上移动到底部。干燥晶片用氮气，再移动从上到下。烘烤的晶片在180℃下进行4分钟。 旋涂再图案化的晶片用2:1 SU-8稀释以2000rpm，持续45秒。 软烘烤在95℃下图案化的晶片2分钟。用接触对准，对准图案化晶片的反应室中的图案，并暴露持续10秒。为2分钟，在95℃下进行曝光后烘烤。 如在步骤1.4.3描述开发晶片。显影和干燥晶片，烘烤晶片在180℃下进行4分钟后。 注：该晶片可以在在前面的步骤中使用的相同的显影剂来开发。 准备控制阀主旋涂未稀释的SU-8光致抗蚀剂上的清洁晶片以2000rpm，持续45秒。 软烘烤晶片在95℃下进行6分钟。使用接触对准器，暴露出晶片与控制阀图案10秒。执行曝光后烘烤在95℃下进行6分钟。 开发晶片中的SU-8开发为2分钟，或直至残留物除去。冲洗用异丙醇，从顶部移到底部。干燥晶片用氮气和烘烤，在180℃进行4分钟。 2. PDMS设备制造 Silanize所有与主人通过〜气相沉积0.2毫升三甲基氯硅烷。 在室温迅速围住主在密闭容器中有几滴硅烷化剂。 注：其他硅烷化协议可以接受38如果执行properly，则PDMS将是容易清除。 混合市售聚（二甲基硅氧烷）（PDMS）基和固化剂以不同比例的设备的两者的膜和控制阀的层，如已被证明在相同的多层阀设计39。使用20：1和5：碱比例1：固化剂为膜和控制阀模具，分别。 对于膜模具，混合10克基础与0.5克固化剂。 注：此卷将被旋涂在膜上的主人。 用于控制阀的模具，混合，在5的基料和固化剂：1的比例。必要模制控制阀将取决于用来保持控制阀的主容器上的PDMS的量;填充容器，使得所述主涂覆有约1cm的PDMS。 调匀既PDMS制剂，和去气它们在真空室中，直到没有气泡可见。将控制阀在主耐热容器中，诸如玻璃盘。仔细倒入5：1的比例PDMS过主人，脱气容器中的第二次。 而控制阀的PDMS容器被脱气，旋涂在20：在膜主1的比例的PDMS由PDMS混合物小心地倾倒在膜上主尽量减少气泡的形成，然后旋涂在主以1,000rpm为45秒。 局部固化两者的主人在烘箱在80℃下进行6分对膜主至15分对控制阀的主人。 备注：当的部分固化的PDMS应该保持其形式，但材料会稍微粘性。如果PDMS尚未固化，再次烘烤以在一个时间几分钟递增直至按下时该材料保持其形式。 从削减控制阀主矩形PDMS模具，剥离模具走平缓。使用0.75毫米打孔打穿成型部件进气孔。 注：该孔可以通过插入23号blun待清洁吨尖端的针，和在模具外部可以用玻璃纸胶带进行清洁，如果需要的话。 使用光学显微镜，以定位在所述膜主反应室，对准与反应室的膜的特性的控制阀的模具组件，并直接放置在控制阀组件上的主膜的顶部。定向控制阀入口到装置的左下角，并确保该反应室及该膜的主通道是矩形的控制阀内可见。 烤对准模具零件在80℃2小时。 注意：膜和控制阀的模具现在将密封在一起，并操纵作为一个模具。 切割层状的PDMS模具离膜的主人，剥离模具远离主轻轻以免穿孔膜。 冲床入口和出口孔，使用0.75毫米的孔打孔细胞提取物输入。通过两层打孔，并如步骤2.6中所述清理它们以相同的方式。 使用感应耦合等离子体清洁器，等离子体处理二者的模具（膜面朝上），并在10.5瓦20秒的第0号玻璃盖玻片。立即删除来自等离子体清洁器的盖玻片和模具和层组件，膜侧朝向玻璃，试图最小化玻璃和模具之间的空气袋。不直接压在膜的输入通道，或膜可退火到玻璃上，使其难以填充反应物的通道。 搬运组装设备时，避免打破玻璃层要特别小心。使用薄的玻璃盖玻片作为装置必须通过采用高倍率油浸目标的玻璃盖玻片被成像 – 如果玻璃太厚，该装置的特征可以是不可见的。 最后，固化的完成装置，在80℃进行2小时。 3.实验FO设置ř无细胞蛋白质合成反应通过煮沸它在去离子水中1小时水合的装置。 注：设备应该有一个阴天的外观，当完全水合。装置还可以以水合物它留下的O / N的无菌水在RT。 使用倒置显微镜与孵育室，设置环境温度至30℃。 注意：此温度被选择以优化的GFP表达T7启动子，所以最佳温度为其它反应可能会发生变化40。 安装设备显微镜阶段持有人用透明胶带和包装，以维持当地的水合装置用湿纸巾的边缘。 使用两个高精度闭环电压压力传感器来调制用于控制阀的致动和试剂输入氮气压力。 注：此协议只被测试与低纯度氮，但是也可使用其它惰性气体。 通过连接第一换能器24号PTFE管，以用隔膜盖4毫升玻璃小瓶中保持一个水容器。所述贮存器连接到使用的第二管通过一个23号钝针头尖端终止了控制阀的入口。 注：两个管渗透油藏隔了两个尖锐的23号针。 24号PTFE管连接到一个男性与男性露儿乐接口连接第二传感器。附加给鲁尔乐23号针头通过与另一23号钝头针头，它被单独组装每个设备管道相连。这个针连接到膜反应通道;用它来从反应信道和输入试剂冲洗水。 使用无细胞蛋白质表达系统，组装的部件，在冰上的CFPS反应，根据制造商的说明。最小化花费保持CFPS试剂在冰上的时间和组装后，立即将反应到器件中。 注释：本设备已经用市售大肠杆菌中使用大肠杆菌提取蛋白的表达工具包和一个质粒组成型表达GFP。总反应体积缩放到25微升 – 这可能是可以使用甚至更低的量为反应物，如果需要的话。作为CFPS试剂倾向于敏感冻融循环，它可能有助于在之前的实验中，合适的体积，使该试剂的等分试样。其它试剂可以加入到反应混合物中，但反应必须被施加到设备之前被完全组装。 组装反应最后加入的DNA的输入。 注意：一旦组装在Eppendorf管中，CFPS反应将开始如果不保持在冰上。由于所需的时间的试剂适用于在设备和开始实验可以变化，它是有帮助的启动计时器一旦反应被组装并混合 – 这将维持一致的实验之间的时间刻度以及援助在排除故障。 使用在步骤3.4.2中所述油管和针连接器，使用1ml注射器收回组装反应进入管。插入钝头针头进入反应室的入口。从注射器卸下针连接器，并将其连接到公对公连接器用于反应室传感器。 施加压力（<10磅）到CFPS反应物来填充通道。取出针时，反应被充满。 来自其它换能器到控制阀入口插入钝管。禁止增压控制阀呢。 放置在安装设备上的阶段。采用明场成像，定位反应室用100X油浸物镜。 致动通过加压控制阀换能器20 psi的控制阀;在该膜的可见光的变化将是显而易见的，当控制阀被致动。专注的反应室的底部。 开始图像采集;生长在荧光瓦特病是在内部和反应室的外部周围可见的，尽管它可能并不明显，在反应的早期阶段。捕捉图像每隔1-3分钟，直到反应达到稳定状态荧光。如果自动聚焦阶段是不可用，简要地重新聚焦之前，被拍摄的图像的每个图像。 注意：虽然将发生某些光漂白，可占只要光漂白的速率是已知的，由于光漂白上相对荧光的影响。这种光漂白速率可以通过暴露的荧光标准，如GFP的已知浓度或荧光团的混合物，以恒定的光漂白过一段时间来估计。 录从反应组件经过对获取的第一图像的时间。 注：这通常需要4-5分钟。 4.图像分析和数据处理使用图像分析软件如ImageJ的，选择反应室作为ROI内部。获得投资回报的所有图像的平均荧光强度值。 注：这是原始的荧光强度跟踪。 执行中的ImageJ此任务使用的时间序列分析仪和投资回报率管理器插件 – 配以时间系列分析仪来选择的围绕每个反应室的内部感兴趣的区域。设置“AutoROIProperties”发送对应于每个反应室的内部的区域，检查“添加点击”，并选择每个室中。 注意：此步骤也可使用椭圆工具周围绘制荧光腔的ROI进行。此ROI大小通常对应于一个30×30象素椭圆用于与100X物镜观察到的10微米直径室。 突出显示所有ROI的ROI经理。使用“多测量”功能通过整个图像堆栈，以确定每个ROI的荧光强度平均值。 注：命名站一个插件ckReg可以用于对准图像堆栈如果必要。 获取原始荧光强度的痕迹在一个实验中所有的腔室之后，通过取一个跨实验均在所有的痕迹，并减去从个别原料痕迹的平均值确定该反应的确定性分量。利用数据分析软件，如IGOR或MS Excel进行这种分析。 注意：这提供了噪声跟踪对于每个反应室。 分析来自使用用于分析从细胞25衍生的基因表达的噪声的相同方法，这些反应室的基因表达的噪声。