관통 마이크로 전극 배열을 펼친 해마 준비에 신경 활동 전파
Summary
우리는 뉴런의 CA1-CA3 배열을 유지 체외 펼쳐진 해마를 개발했다. 관통 마이크로 전극 배열과 결합하여 신경 활동 모두 종 방향 및 횡 방향으로 모니터링 할 수있다. 전체 해마 전파를 동시에 기록 할 수 있으므로이 방법은 해마 슬라이스 제제에 비해 많은 장점을 제공한다.
Abstract
이 프로토콜은 해마 신경 활동에 매핑하는 마이크로 머신 어레이와 결합 체외 플랫 해마 준비 새로운 제조 방법을 설명한다. 가로 해마 슬라이스 준비는 해마의 전기 생리학을 연구하는 가장 일반적인 조직의 준비입니다. 길이 해마 슬라이스는 해마 연결 길이를 조사하기 위하여 개발되었다. 그 두께가 충분한 산소 확산을 허용하기 때문에 본래 마우스 해마는 시험관 내에서 유지 될 수있다. 조직의 일부가 누락되거나 접혀 하나이기 때문에, 이러한 세 가지 제제는 신경 전달에 대한 직접 액세스를 제공하지 않는다. 펼쳐진 그대로 해마는 가로와 체외에서 해마의 신호 전파의 전체 범위를 분석 할 수있는 조직에 직접 액세스를위한 평면 구성의 종 방향 연결을 모두 제공합니다. 효과적으로 t에서 신경 활동을 모니터하기 위해서그 세포층, 정의를 제조 하였다 마이크로 전극 어레이 (PMEA)을 만들어 관통 펼친 해마인가. 높이 200 μm의 64 전극 PMEA 깊은 마우스 해마 내부의 신경 활동을 기록 할 수있다. 펼친 해마 준비 및 PMEA의 독특한 조합 잡음비 높은 신호 해마의 이차원 CA1-CA3 영역의 속도 및 신경 활동의 전파 방향을 연구하는 새로운 시험관 도구를 제공한다.
Introduction
신경 신호의 신경 전도 또는 전파를 이해하는 것은 뇌 1-3의 정상적인 기능 및 병리학 적 조건 모두에서 신경 통신의기구의 결정에 매우 중요하다. 해마는 메모리, 및 공간 추적 같은 몇몇 뇌 기능에 중요한 역할을 극적 행동뿐만 아니라 1,6- 영향 여러 병리학 적 변화에 관여하기 때문에 뇌에서 가장 광범위하게 연구 한 구조이다. 해마가 복잡한 조직을 나타내고 있지만, 그 구조의 다른 요소가 용이하게 식별되고 슬라이스 제조 4-6에 액세스 할 수있다. 해마의 횡단 방향으로, 신경 활동은 치아 이랑 (DG), CA3, CA1 andsubiculum 4,5-를 포함 트라이 시냅스 경로를 통해 전파하는 것으로 알려져있다. 이 시냅스 전달 축삭 전도의 대화를 위해 중요한 역할 것으로 여겨진다이 가로 회로 4,6에에. 그러나, 신경 신호의 전달 종횡 4,6 모두에서 발생한다. 이 해마가 완전히 전파 (4)의 특정 방향으로의 관찰을 제한 조각 제제를 사용하여 조사 할 수 없다는 것을 의미한다. 세로 슬라이스 종축을 따라 5 축삭 경로를 조사하기 위해 개발되었다. 연구자들은 주로 가로 및 세로 축에 각각 6 함께 행동 별 감마 세타 진동을 관찰했다. 이러한 동작은 개별적으로 연구되고있다, 아직 두 방향에 대한 동시 접근이 이러한 행동을 이해하는 것이 중요하다. 심지어 그대로 해마 제제의 발달로 인한 해마 (4)의 절첩 구조로 조직 전체에 걸쳐 전파를 모니터하는 것은 곤란하다. 펼쳐진 해마는 포장 뉴런에 대한 액세스를 제공합니다이차원 평면 셀 7,8 층의 형태 일 수있다.
치아 이랑 (DG) (도 1)을 전개함으로써, 해마, 종횡 연결 모두 CA3 및 CA1이 모두 함유 이차원 시트에 배치 된 피라미드 전지 층으로 그대로 유지되는 직사각형 구성으로 편평한 형상을 채용 신경 전달을 조사하기 위해 이용 될 수 신경 조직의 평평한 부분을 이탈 (도 2) 8. 신경 활동이어서 개별 유리 피펫, 미세 전극 배열, 자극 전극뿐만 아니라, 전압 감응 염료 (VSD) -3,7,8-으로 모니터링 할 수있다. 또한, 트랜스 제닉 마우스에서 유전자 부호화 전압 표시기 전파 패턴 (9)을 추적하는 데 사용될 수있다.
펼친 해마 네트워크의 평면 구성은 광 기록 방법뿐만 아니라 미세 전극 배열에 매우 적합하다. M시중에서 판매하는 배열의 OST는 평면 또는 로우 프로파일 전극을 제조하고 조직 슬라이스 배양 신경 세포 10-12 모두에서 신경 활동을 기록 할 수 있습니다. 뉴런의 소마가 조직으로 깊은 위치 보낸 신호가 그대로 조직으로부터 수득되는 경우에는, 신호 대 잡음비 (SNR)가 감소한다. 고 종횡비 미세 전극 배열은 SNR을 향상시키기 위해 필요하다.
이러한 취지, 관통 미세 전극 배열 (PMEA)은 실험실에서 개발되었으며, 펼친 해마 7,13으로 20 ㎛, 직경 200 ㎛, 높이 64 스파이크를 삽입하여 조직으로 조사 할 수있는 기능을 제공한다 . 미세 전극이 배열은 전압 감응 염료 촬상에 비해 더 높은 SNR을 가지고 있으며, SNR은 실험 7,13 동안 안정적으로 유지. 해마 펼친 준비 및 PMEA의 조합은 투자 할 수있는 새로운 방법을 제공한다2 차원 평면 위에 신경 전달을 igate. 이 기술을 사용하는 실험들은 이미 신경 활동 독립적 시냅스 또는 전기 시냅스 (7)의 전파 될 수있다 해마에서 신경 신호 전달 기전에 대한 의미있는 결과를 수득했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
해마의 종 방향 및 횡 방향 축이 관통하는 미세 전극 배열과 조합 보존 펼친 해마 제제의 개발은, 해마 7 해부학 신경 연결 또는 전파를 조사하는 강력한 도구를 제공한다. 이 전개 절차는 성인 쥐에서 해마를 공부에 적용됩니다. 이러한 준비와 최근의 연구는 4-AP에 의한 간질 활동이 펼쳐진 해마의 전체 영역에 걸쳐 대각선 파면 (그림 6) 7,8로 전파 할 수 있음을 보여 ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 and by the E.L. Lindseth endowed chair to Dominique M. Durand. We thank Dr. Andrew M. Rollins’ laboratory for the help on the OCT imaging.
Materials
| desiccator jar | LABRECYCLERS Inc. | 5410 | Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. |
| A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus | N/A | N/A | A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. |
| Custom made tissue recovery chamber | N/A | N/A | Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF. |
| Straight Operating Scissors | Fisher Scientific | S17336B Medco Instruments No.:81995 | This scissors is used to decapitate the mice. |
| Integra Miltex Goldman-Fox Scissors | Fisher Scientific | 12-460-517 MILTEX INC No.:5-SC-320 | This scissors is used to cut the skull of the mice. |
| Miltex Hysterectomy Forceps |
Claflin Medical equipment | CESS-722033-00001 | This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain |
| Micro Spatula | Cardinal Health | This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. | |
| Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula | Cardinal Health | this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber. | |
| small paint brush | Lowe's | tem #: 105657 Model #: 90219 | The one with the smallest size in a normal paint brush package |
| Fire polished glass help tool | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass needle | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass tool with a metal wire loop | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop. |
| Custom made glass solution dropper | N/A | N/A | This tool was made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end. |
| Custom made tissue anchor | N/A | N/A | Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. |
| Custom fabricated microelectrode array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Custom made filter and amplifiers circuits for the array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Data acquisition processor 3400a | Microstar Laboratories | N/A | This is a complete data acquisition system with A/D converter. |
Referenzen
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