العصبية آخر نشر في إعداد الحصين تكشفت مع اختراق الصغرى، والقطب صفيف
Summary
قمنا بتطوير الحصين تكشفت في المختبر الذي يحافظ CA1-CA3 مجموعة من الخلايا العصبية. جنبا إلى جنب مع اختراق مجموعة الكهربائي الصغير، النشاط العصبي يمكن رصدها في كل من التوجهات الطولي والعرضي. يوفر هذا الأسلوب المزايا على الاستعدادات شريحة الحصين كما نشر في قرن آمون كلها يمكن تسجيلها في وقت واحد.
Abstract
يصف هذا البروتوكول وسيلة لإعداد جديدة في المختبر إعداد الحصين شقة جنبا إلى جنب مع مجموعة تشكيله الدقيقة لرسم خريطة النشاط العصبي في قرن آمون. من عرضية إعداد شريحة الحصين هو إعداد الأنسجة الأكثر شيوعا لدراسة الحصين الكهربية. وقد تم تطوير شريحة الحصين طولية أيضا من أجل التحقيق في وصلات طولية في قرن آمون. ويمكن أيضا أن يستمر الحصين الماوس سليمة في المختبر بسبب سمكه يسمح انتشار الأوكسجين الكافي. ومع ذلك، لا هذه التحضيرات ثلاثة لا توفر الوصول المباشر إلى نشر العصبي منذ بعض الأنسجة إما مفقود أو مطوية. يوفر الحصين سليمة تكشفت كل من عرضية وطولية اتصالات في تكوين شقة للوصول المباشر إلى الأنسجة لتحليل المدى الكامل لانتشار الإشارة في قرن آمون في المختبر. من أجل مراقبة النشاط العصبي من ر فعالانه طبقة الخلايا، أدلى مخصص اختراق مجموعة صغيرة القطب (PMEA) كانت ملفقة وتطبيقها على الحصين تكشفت. وPMEA مع أقطاب 64 من 200 ميكرومتر في الطول يمكن تسجيل النشاط العصبي في عمق الحصين الماوس. مزيج فريد من إعداد الحصين تكشفت وPMEA يوفر أداة جديدة في المختبر لدراسة سرعة واتجاه الانتشار من النشاط العصبي في مناطق CA1-CA3 ثنائية الأبعاد من الحصين مع إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء.
Introduction
فهم التوصيل العصبي أو انتشار الإشارات العصبية من الأهمية بمكان لتحديد آلية التواصل العصبي في كل من الوظيفة العادية والحالات المرضية في الدماغ 1-3. الحصين هو واحد من الهياكل الأكثر درس على نطاق واسع في الدماغ لأنه يلعب دورا أساسيا في العديد من وظائف المخ مثل الذاكرة، وتتبع المكاني وتشارك في العديد من التغيرات المرضية التي تؤثر على السلوك بصورة جذرية فضلا 1،6. وعلى الرغم من الحصين يسلك منظمة معقدة، وعناصر مختلفة من هيكلها يمكن التعرف بسهولة والوصول إليها في إعداد شريحة 4-6. في الاتجاه العرضي للقرن آمون، ومن المعروف النشاط العصبي لنشر من خلال مسار ثلاثي متشابك التي تشكل التلفيف المسنن (DG)، CA3، CA1 andsubiculum 4،5. ويعتقد أن انتقال متشابك والتوصيل المحاور تلعب دورا رئيسيا لcommunicatiعلى في هذه الدائرة عرضية 4،6. ومع ذلك، والإكثار من الإشارة العصبية يحدث في كل من عرضية وطولية 4،6 الاتجاهات. وهذا يعني أن الحصين لا يمكن تحقيق كامل عن طريق استخدام مستحضرات شريحة التي تحد من المراقبة لاتجاه معين من نشر 4. تم تطوير شريحة طولية للتحقيق في مسارات محور عصبي على طول المحور الطولي 5. وقد لاحظ الباحثون جاما وثيتا التذبذبات سلوك معين في الغالب على طول عرضية وطولية محاور على التوالي 6. وقد تم دراسة هذه السلوكيات على حدة، حتى الآن الدخول في وقت واحد لكلا الاتجاهين أمر بالغ الأهمية لفهم هذه السلوكيات. حتى مع تطور إعداد الحصين سليمة، فمن الصعب رصد انتشار في جميع أنحاء الأنسجة كامل بسبب هيكل مطوية من الحصين 4. يوفر الحصين تكشفت الوصول إلى الخلايا العصبية معبأةفي شكل طبقة الخلايا ثنائية الأبعاد 7،8 مسطح.
التي تتكشف التلفيف المسنن (DG) (الشكل 1)، وقرن آمون يعتمد شكل بالارض مع تكوين مستطيل فيه كلا عرضية وطولية الاتصالات لا تزال سليمة مع طبقة الخلايا الهرمية مرتبة في ورقة ثنائية الأبعاد تحتوي على كل CA3 وCA1، ترك شقة قطعة من الأنسجة العصبية التي يمكن استخدامها لتحقيق انتشار العصبي (الشكل 2) 8. ويمكن بعد ذلك النشاط العصبي يمكن رصدها مع ماصات الفردية والزجاج، والمصفوفات مسرى مكروي، تحفيز كهربائي، وكذلك الأصباغ الحساسة الجهد (VSD) 3،7،8. وبالإضافة إلى ذلك، المشفرة وراثيا مؤشر الجهد من الفئران المعدلة وراثيا يمكن أن تستخدم لتتبع نمط انتشار 9.
التكوين المسطح من شبكة الحصين المطوية هي مناسبة تماما لتسجيل طريقة البصرية ولكن أيضا لمجموعة ومسرى مكروي. Mهي ملفقة معاهدة الفضاء الخارجي للصفائف المتاحة تجاريا مع أقطاب الملف الشخصي شقة أو منخفضة ويمكن تسجيل النشاط العصبي في كل من شرائح الأنسجة والخلايا العصبية مثقف 10-12. ومع ذلك، فإن نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) تنخفض عندما يتم الحصول على إشارات من لأنسجة سليمة منذ سوما من الخلايا العصبية تقع في عمق الأنسجة. مطلوبة صفائف مسرى مكروي الكهربائي مع الجانب نسب عالية لتحسين SNR.
لهذا الغرض، تم وضع اختراق مجموعة مسرى مكروي (PMEA) في المختبر لدينا، ويوفر القدرة على تحقيق مباشرة في الأنسجة عن طريق إدراج 64 المسامير التي يبلغ قطرها 20 ميكرومتر وارتفاع 200 ميكرون في قرن آمون تكشفت 7،13 . هذه المجموعة مسرى مكروي ديها SNR أعلى بالمقارنة مع الجهد حساسة التصوير صبغ وSNR لا تزال مستقرة خلال تجربة 7،13. مزيج من إعداد الحصين تكشفت وPMEA يوفر طريقة جديدة للاستثمارآي جيت نشر العصبي على طائرة ثنائية الأبعاد. التجارب باستخدام هذه التقنية قد أسفرت بالفعل عن نتائج هامة حول آليات انتشار الإشارة العصبية في الحصين حيث النشاط العصبي يمكن أن تنتشر بشكل مستقل من نقاط الاشتباك العصبي متشابك أو الكهربائية 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
تطوير إعداد الحصين تكشفت، حيث يتم الاحتفاظ المحاور الطولية والعرضية للقرن آمون في تركيبة مع مجموعة ومسرى مكروي اختراق، يوفر أداة قوية للتحقيق في صلات التشريح أو انتشار العصبية في الحصين 7. هذا الإجراء تتكشف ينطبق على دراسة الحصين في فئران بالغة أيضا. وأظهرت ال?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 and by the E.L. Lindseth endowed chair to Dominique M. Durand. We thank Dr. Andrew M. Rollins’ laboratory for the help on the OCT imaging.
Materials
| desiccator jar | LABRECYCLERS Inc. | 5410 | Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. |
| A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus | N/A | N/A | A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. |
| Custom made tissue recovery chamber | N/A | N/A | Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF. |
| Straight Operating Scissors | Fisher Scientific | S17336B Medco Instruments No.:81995 | This scissors is used to decapitate the mice. |
| Integra Miltex Goldman-Fox Scissors | Fisher Scientific | 12-460-517 MILTEX INC No.:5-SC-320 | This scissors is used to cut the skull of the mice. |
| Miltex Hysterectomy Forceps |
Claflin Medical equipment | CESS-722033-00001 | This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain |
| Micro Spatula | Cardinal Health | This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. | |
| Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula | Cardinal Health | this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber. | |
| small paint brush | Lowe's | tem #: 105657 Model #: 90219 | The one with the smallest size in a normal paint brush package |
| Fire polished glass help tool | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass needle | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass tool with a metal wire loop | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop. |
| Custom made glass solution dropper | N/A | N/A | This tool was made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end. |
| Custom made tissue anchor | N/A | N/A | Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. |
| Custom fabricated microelectrode array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Custom made filter and amplifiers circuits for the array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Data acquisition processor 3400a | Microstar Laboratories | N/A | This is a complete data acquisition system with A/D converter. |
Referenzen
- Richardson, K. A., Schiff, S. J., Gluckman, B. J. Control of traveling waves in the Mammalian cortex. Phys Rev Lett. 94 (2), 028103-028112 (2005).
- Luhmann, H. J., Dzhala, V. I., Ben-Ari, Y. Generation and propagation of 4-AP-induced epileptiform activity in neonatal intact limbic structures in vitro. Eur J Neurosci. 12 (8), 2757-2768 (2000).
- Grinvald, A., Manker, A., Segal, M. Visualization of the spread of electrical activity in rat hippocampal slices by voltage-sensitive optical probes. J Physiol. 333, 269-291 (1982).
- Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (37), 13295-13300 (2005).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neurowissenschaften. 31 (3), 571-591 (1989).
- Albani, S. H., McHail, D. G., Dumas, T. C. Developmental studies of the hippocampus and hippocampal-dependent behaviors: insights from interdisciplinary studies and tips for new investigators. Neurosci Biobehav Rev. 43, 183-190 (2014).
- Zhang, M., et al. Propagation of Epileptiform Activity Can Be Independent of Synaptic Transmission, Gap Junctions, or Diffusion and Is Consistent with Electrical Field Transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
- Kibler, A. B., Durand, D. M. Orthogonal wave propagation of epileptiform activity in the planar mouse hippocampus in vitro. Epilepsia. 52 (9), 1590-1600 (2011).
- Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108 (11), 3147-3160 (2012).
- Wingenfeld, K., Wolf, O. T. Stress , memory, the hippocampus. Front Neurol Neurosci. 34, 109-121 (2014).
- Liu, J. S., et al. Spatiotemporal dynamics of high-K+-induced epileptiform discharges in hippocampal slice and the effects of valproate. Neurosci Bull. 29 (1), 28-36 (2013).
- Oka, H., Shimono, K., Ogawa, R., Sugihara, H., Taketani, M. A new planar multielectrode array for extracellular recording: application to hippocampal acute slice. J Neurosci Methods. 93, 61-68 (1999).
- Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro. J Neurosci Methods. 204 (2), 296-305 (2012).
- Schechter, L. E. The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices. J Pharmacol Exp Ther. 282 (1), 262-270 (1997).
- Perreault, P., Avoli, M. 4-aminopyridine-induced epileptiform activity and a GABA-mediated long-lasting depolarization in the rat hippocampus. J Neurosci. 12 (1), 104-115 (1992).
- Chesnut, T. J., Swann, J. W. Epileptiform activity induced by 4-aminopyridine in immature hippocampus. Epilepsy Res. 2 (3), 187-195 (1988).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In Vitro Microelectrode Array Technology and Neural Recordings. Crit Rev Biomed Eng. 39 (1), 45-62 (2011).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. Hippocampal neuron firing and local field potentials in the in vitro 4-aminopyridine epilepsy model. J Neurophysiol. 108 (9), 2568-2580 (2012).
