Forward Genetica schermi usando macrofagi per identificare<em> Toxoplasma gondii</em> geni importanti per la Resistenza di IFN-γ-Dependent cellulare Immunità autonoma

Toxoplasma gondii (T. gondii) è un intracellulare obbligato, patogeno da protozoi. E 'l'agente eziologico della toxoplasmosi, un pericolo per la salute in soggetti immunocompromessi. E 'anche il sistema di modello per altri patogeni Apicomplexa che infettano gli esseri umani, tra cui Cryptosporidium e Cyclospora. La toxoplasmosi è più comunemente acquisito attraverso l'ingestione di cibo o acqua contaminati con la fase bradyzoite o oocisti del parassita. Dopo l'ingestione, queste fasi convertono alla fase tachizoite del parassita che replica all'interno di cellule ospiti e diffonde per via sistemica. Cellule T, IFN-γ e, in misura minore, ossido nitrico ^1-4, sono importanti per il controllo di infezione, ma non sono in grado di eliminare la malattia, in proporzione tachizoiti convertono alla fase bradyzoite che sono protetti all'interno cisti tissutali causando una infezione cronica di lunga durata. In realtà, non esistono terapie efficaci contro la cisti s cronicatage della malattia. Grave toxoplasmosi è più spesso dovuta alla riattivazione di infezione persistente, con la fase bradyzoite del parassita riconversione palco rapidamente replicando caratteristico tachizoite di infezione primaria e acuta.

Sopravvivenza All'inizio faccia della risposta immunitaria innata è importante per permettere al parassita di raggiungere numeri parassiti sufficiente, nonché di raggiungere siti distali, per consentire costituzione di infezione cronica. T. gondii è evoluto strategie per contrastare i meccanismi di difesa dell'ospite che probabilmente contribuiscono alla sua capacità di replicare e diffondere all'inizio dell'infezione. Primo, T. gondii forma un PV unico durante parassita invasione che è in gran parte separata dai processi endocitiche e esocitosi della cellula ospite rispetto ad altri patogeni intracellulari ^5-9. Inoltre, come tutti di successo patogeni intracellulari T. gondii modifica la sua cellula ospite per creare un ambiente permissivo fo la crescita. Questo include l'espressione genica della cellula ospite riprogrammazione alterando fattori di trascrizione della cellula ospite, comprese quelle importanti per la regolazione attivazione delle cellule ^10-15. ROP16 ^16-19, GRA15 ^{20, 21} e GRA16 GRA24 ²² hanno tutti dimostrato di essere importante nella regolazione della risposta trascrizionale e segnalazione cellulare cascate di cellule ospiti infettate con T. gondii. Studi recenti, con incroci genetici tra ceppi di parassiti con fenotipi distinti sono stati molto produttivi per identificare i geni che sono alla base di parassiti tratti genotipo-dipendente parassiti, tra cui l'evasione legate all'immunità GTPases (IRG) ^16,19,23-26. Nei topi, legate all'immunità GTPasi (IRG) sono fondamentali per il controllo di tipo II e III genotipi del parassita, mentre il tipo molto virulenta I genotipi sono evoluti meccanismi per eludere le IRG murini. Tuttavia, è anche evidente che il parassita è evoluto meccanismi per eludere mezzi antimicrobicatori in aggiunta ai IRGs e che alcuni di questi meccanismi possono essere conservati tutti genotipi parassita ^27,28. Inoltre, si sa molto poco circa i mediatori critici di cellule dell'immunità autonoma contro T. gondii durante toxoplasmosi umana. Parasite geni importanti per la resistenza ai mediatori di cellule dell'immunità autonoma possono essere importanti per la sopravvivenza durante tachizoite a bradyzoite conversione che può anche essere attivato da risposta immunitaria. Ad esempio, l'ossido nitrico ad alti livelli può sopprimere la replicazione parassita in macrofagi infettati ma può anche stimolare tachizoite a bradyzoite conversione con conseguente produzione cisti ^30-32.

ToxoDB è un database genomica funzionale per T. gondii che funziona come una risorsa critica per il campo in termini di fornitura di informazioni di sequenza del genoma del parassita e l'accesso ai dati in scala genomica editi e inediti tra cui le annotazioni di comunità, gene exp ression e proteomica dati ^33. Simili molti patogeni protozoarie, la maggior parte del genoma è costituito da geni ipotetici senza informazioni disponibili sulla base gene omologia fornire una conoscenza loro potenziali funzioni. Così, la genetica in avanti è un potente strumento per identificare i geni parassiti nuovi importanti per evasione immune, la conversione cisti e altre funzioni critiche per parassita patogenesi e per la conversione tra le varie fasi di sviluppo differenti. Un ulteriore punto di forza genetica diretta è che può essere usato come un approccio relativamente non polarizzato per interrogare il parassita per i geni che sono importanti per compiti specifici in patogenesi, comprese evasione immune e formazione di cisti. Recenti miglioramenti a sequenziamento di nuova generazione per la profilazione mutazionale hanno fatto un metodo di scelta per identificare i geni parassita responsabile di genetica a termine studi utilizzando sia chimico inserzionale mutagenesi ^34-37.

S copi "> E 'importante identificare le vulnerabilità in T. gondii che possono essere sfruttate per migliorare l'efficacia delle cellule meccanismi immunitari autonomi contro il parassita particolare quelli che potrebbero essere anche attivo contro il palco cisti resistente. A tal fine, in vitro murino infezione macrofagi e modello di attivazione è stato sviluppato per identificare le mutazioni nel parassita che specificamente compromettere T. gondii idoneità dopo l'attivazione dei macrofagi infetti, ma non in macrofagi ingenui. Questa schermata macrofagi è stata utilizzata per interrogare una libreria di T. gondii mutanti inserzionali per fine identificare i geni T. gondii importanti per la resistenza a ossido nitrico ^27,28. L'isolamento di un pannello di mutanti T. gondii con resistenza ridotta alla attivazione di macrofagi infettati, in particolare una marcata sensibilità per ossido nitrico, dimostrato l'utilità di schermo per identificare geni parassita importanti per la resistenzaai mediatori di cellule dell'immunità autonome diverso i meccanismi di resistenza descritti per i IRG murini ^28. Mutagenesi inserzionale presenta vantaggi rispetto mutagenesi chimica in termini di generazione di un numero limitato di mutazioni casuali in ogni clone parassita e, in teoria, più facile identificazione del sito di mutazione. Tuttavia, identificando il sito di inserzione del plasmide genomico in T. mutanti inserzionali gondii, in pratica, è stato sorprendentemente difficile in molti casi ^37. Inserimento di un plasmide in un gene è anche probabile che interrompere la funzione di un gene in contrasto mutagenesi chimica che provoca tipicamente cambiamenti singolo nucleotide. Tuttavia, mutagenesi chimica sia con N-etil-N-nitrosourea (ITA) o sulfonato ethylmethane (EMS) può offrire una maggiore capacità di analizzare una porzione più ampia del genoma del parassita, rispetto alla mutagenesi inserzionale, in quanto crea più polimorfismi a singolo nucleotide ( stimato a 10 -100) per mutante ³⁴, 38. Inoltre, i recenti progressi in tutto il profiling genoma ha reso possibile l'utilizzo di sequenziamento di nuova generazione per identificare i geni candidati più probabili responsabili del fenotipo identificato di un parassita mutato ^34,38. Indipendentemente dal metodo mutagenesi, conferma del ruolo del gene parassita resistenza alla attivazione dei macrofagi richiede infine delezione genica e complementazione di soddisfare postulati di Koch molecolare.

La capacità di analizzare la funzione di un gene mediante manipolazione genetica sia del parassita e macrofagi è importante in quanto molti dei geni identificati tramite genetica diretta in T. gondii, così come altri agenti patogeni, sono ancora caratterizzati come geni ipotetici con poca o nessuna omologia di sequenza con altre proteine ​​con funzioni note. La carta corrente delinea un approccio generale che può essere utilizzato per identificare se il gene interrotto in un mutante è importante per la resistenza ad una nota osconosciuto mediatore della cellula immunità autonoma. L'analisi iniziale di accoglienza fattori antimicrobici è effettuata valutando la sopravvivenza di tipo selvatico e parassiti mutanti in macrofagi da topi wild type rispetto a quelli con specifiche delezioni geniche in ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS), gp-91 phox (NADPH ossidasi), e specifiche GTPasi legate all'immunità (IRG). Questo determinerà se i geni identificati parassita sono importanti per la resistenza a ossido nitrico, intermedi reattivi dell'ossigeno o legate all'immunità GTPases ²⁸ rispettivamente o se un meccanismo immunitario sconosciuto è coinvolto. L'attivazione dei macrofagi infetti sia con IFN-γ e LPS, descritti nel protocollo attuale, si traduce principalmente nel isolamento di geni importanti per la resistenza dei parassiti a ossido nitrico ^28. L'uso di agenti farmacologici che inducono ossido nitrico in assenza di attivazione dei macrofagi (donatori di ossido nitrico) ha confermato che la maggior parte dei geni identificati fosse importante per riresistenza a ossido nitrico, piuttosto che l'ossido di azoto in concerto con i mediatori aggiuntivi associati macrofagi attivazione ^28.

Fase uno e due descrivono uno schermo genetica avanti volto a isolare i mutanti del parassita con un difetto di forma fisica dopo l'attivazione dei macrofagi del midollo osseo infette in vitro. Passo si descrive un'analisi titolazione della dose per determinare empiricamente una dose di IFN-γ e LPS da utilizzare per l'attivazione dei macrofagi, che riduce la replicazione del parassita, ma non inibisce completamente la replica di tipo T. selvaggia ceppo parentale gondii che viene utilizzato per la creazione della biblioteca di mutanti del parassita. Fase due descrive la schermata genetica avanti dei cloni mutanti nei macrofagi in piastre da 96 pozzetti. Fase tre delinea un approccio per confermare il fenotipo di ogni mutante identificato nella schermata dei 96 pozzetti e di valutare se il difetto in ogni mutante influenza la sopravvivenza del parassita, la replica,o di produzione cisti in risposta all'attivazione dei macrofagi. Fase quattro descrive l'uso di macrofagi del midollo osseo da topi con delezioni in specifiche vie antimicrobiche per identificare i mediatori immunitari a cui il mutante parassita è specificamente sensibili. Fase cinque delinea un approccio per determinare se un mutante parassita è anche compromesso da in vivo patogenesi come valutato dalla produzione cisti nel cervello dei topi infettati.