קדימה גנטיקה מסכי שימוש המקרופאגים לזיהוי<em> Toxoplasma gondii</emחסינות אוטונומית נייד להתנגדות לIFN-γ-Dependent> גנים חשובים

gondii Toxoplasma (ט gondii) הוא תאיים לחייב, הפתוגן protozoal. זה הוא הגורם הסיבתי של טוקסופלזמוזיס, סכנה בריאותית באנשי מדוכאי חיסון. כמו כן, מערכת המודל לפתוגנים apicomplexan אחרים שלהדביק בני אדם ובכלל זה Cryptosporidium וCyclospora. טוקסופלזמוזיס נרכש הנפוץ ביותר בבליעת מזון או מים מזוהמים בשלב bradyzoite או oocyst של הטפיל. על הבליעה, שלבים אלה להמיר לבמה tachyzoite של הטפיל שמשכפל בתוך תאי מארח ומפיץ מערכתי. תאי T, IFN-γ ו, ובמידה פחותה, תחמוצת חנקן ^1-4, חשוב על שליטה בזיהום, אבל הם לא מסוגלים לחסל את המחלה, כאחוז מtachyzoites להמיר לבמה bradyzoite שמוגנות בתוך ציסטות רקמה וכתוצאה מכך זיהום כרוני חיים ארוכים. למעשה, אין תרופות יעילות נגד של ציסטה הכרוניתכאחוז מהמחלה. טוקסופלזמוזיס החמור הוא לרוב עקב ההפעלה מחדש של זיהום מתמשך, עם שלב bradyzoite של הטפיל המרה בחזרה למאפיין השלב tachyzoite מהירות משכפלים של הדבקה ראשונית וחריפה.

הישרדות בשלב מוקדמת של הפנים של התגובה החיסונית המולדת היא חשובה על מנת לאפשר את הטפיל להגיע מספרי טפיל מספיק, כמו גם להגיע לאתרי דיסטלי, כדי לאפשר הקמתה של דלקת כרונית. ט גונדי התפתח אסטרטגיות כדי לנטרל מנגנוני הגנת מארח שצפויה לתרום ליכולתו לשכפל ולהפיץ בשלבי הדבקה ראשוני. ראשית, ט ' גונדי יוצר PV ייחודי במהלך הפלישה טפילה שמופרד במידה רבה מתהליכי endocytic וexocytic של התא המארח בהשוואה לפתוגנים תאיים אחרים ^5-9. כמו כן, כמו כל ט פתוגנים תוך-התאי המוצלח גונדי משנה תא המארח שלה כדי ליצור סביבה מתירנית fאו צמיחה. זה כולל ביטוי מארח תכנות מחדש של תאים על ידי שינוי גנטי גורמי שעתוק תא מארח כולל אלו חשובים להסדרת תא הפעלה ^{10-15. 16-19} ROP16, GRA15 ^20, GRA16 ²¹ ו ^-22 GRA24 כולם הוכחו כחשוב בויסות תגובת תעתיק ותא איתות מפלים של תאי מארח נגועים בט גונדי. מחקרים שנעשה לאחרונה שימוש בצלבים גנטיים בין זני טפיל עם פנוטיפים שונים היו יעילים ביותר בזיהוי גני טפיל העומדים בבסיס תכונות גנוטיפ תלוי טפיל כוללים התחמקות של GTPases החסינות קשורה (IRGs) ^16,19,23-26. בעכברים, GTPases החסינות קשורה (IRGs) הם קריטיים לשליטה של ​​סוג II ו- III גנוטיפים של הטפיל ואילו גנוטיפים סוג מאוד ארסי אני התפתחו מנגנונים להתחמק IRGs העכברי. עם זאת, ברור גם שהטפיל התפתח מנגנונים להתחמק תקשורת מיקרוביאליתtors בנוסף לIRGs וכי חלק ממנגנונים אלה עשויים להיות נשמר על פני גנוטיפים טפיל ^27,28. בנוסף, מעט מאוד ידוע על המתווכים הקריטיים של חסינות אוטונומית תא נגד T. גונדי בטוקסופלזמוזיס האנושי. גני טפיל חשובים להתנגדות למתווכים של חסינות אוטונומית תא יכולים להיות גם חשובים להישרדות במהלך tachyzoite לbradyzoite המרה אשר יכול גם להיות מופעלת על ידי תגובות חיסוני מארח. לדוגמא, תחמוצת חנקן ברמות גבוהות יכולה לדכא את התרבות טפילה במקרופאגים נגועים אבל זה גם יכול לעורר tachyzoite לbradyzoite המרה וכתוצאה מכך ייצור ציסטה ^30-32.

ToxoDB הוא מסד נתונים הגנומי פונקציונלי לט גונדי המתפקד כמשאב קריטי עבור השדה במונחים של מתן מידע לרצף הגנום הטפיל וגישה לנתונים בקנה מידה הגנומי שפורסמו ושלא פורסמו כולל הסברים קהילה, exp הגן נתונים ression ופרוטאומיקה ^33. בדומה לרבים פתוגנים protozoal, רוב הגנום מורכב של גנים היפותטי ללא מידע זמינים על בסיס הומולוגיה גנטית כדי לספק תובנות לגבי פונקציות הפוטנציאל שלהם. לפיכך, גנטיקה קדימה היא כלי רב עוצמה לזיהוי גני טפיל רומן חשובים להעלמה חיסונית, המרת ציסטה ופונקציות אחרות קריטיות להיווצרות מחלה טפילה, כמו גם עבור המרה בין שלבי התפתחות שונים. כוח נוסף של גנטיקה קדימה הוא שניתן להשתמש בו כגישה יחסית שאינו מוטה לחקור את הטפיל כלגנים החשובים למשימות ספציפיות בפתוגנזה, כוללים העלמת חיסונית והיווצרות ציסטה. השיפורים אחרונים ברצף של הדור הבא לפרופיל מוטאציות הפכו אותה לשיטת בחירה לזיהוי גני הטפיל האחראים ממחקרי גנטיקה קדימה באמצעות mutagenesis הכימי וinsertional ^34-37.

ntent "> חשוב לזהות נקודות תורפה בט gondii שניתן לנצל כדי לשפר את האפקטיביות של מנגנוני חיסון אוטונומיים תא נגד הטפיל במיוחד אלה שיכולים להיות גם פעילים נגד שלב ציסטה עמיד. לקראת מטרה זו, במבחנה עכברית זיהום מקרופאג ומודל הפעלה פותח כדי לזהות מוטציות בטפיל שדווקא לפגוע בכושר gondii ט לאחר הפעלה של מקרופאגים הנגועים אך לא במקרופאגים הנאיביים. מסך מקרופאג זה שימש לחקור את ספרייה של מוטציות insertional ט gondii כדי סופו של דבר זיהוי גני ט gondii חשובים להתנגדות לתחמוצת חנקן ^27,28. הבידוד של פנל של מוטציות ט gondii עם התנגדות לקויה להפעלה של מקרופאגים הנגועים, במיוחד רגישות ניכרת לתחמוצת חנקן, הוכיח את התועלת של המסך כדי לזהות גני טפיל חשובים להתנגדותלמתווכים של תא חסינות אוטונומית אחרת מאשר מנגנוני ההתנגדות תיארו לIRGs העכברי ^28. יש mutagenesis insertional יתרונות על פני mutagenesis הכימי במונחים של יצירת מספר מוגבל של מוטציות אקראיות בכל שיבוט טפיל ו, בתאוריה, זיהוי קל יותר של האתר של מוטציה. עם זאת, זיהוי האתר הגנומי של הכנסת פלסמיד בט מוטציות insertional גונדי, בפועל, היו קשות באופן מפתיע, במקרים רבים ^37. החדרת פלסמיד לגן היא גם עלולה לשבש את תפקודו של גן בניגוד לmutagenesis הכימי שבדרך כלל תוצאות שינויי נוקלאוטיד בודדים. עם זאת, mutagenesis הכימי עם או N-nitrosourea N-אתיל-(ENU) או sulfonate ethylmethane (EMS) עשוי להציע יכולת מוגברת לנתח חלק גדול יותר של הגנום הטפיל, בהשוואה לmutagenesis insertional, כפי שהוא יוצר פולימורפיזם של נוקלאוטיד הבודד מרובה ( מוערך בכ 10 -100) למוטציה ³⁴, 38. יתר על כן, התקדמות שחלה באחרונה בפרופיל הגנום כולו הפכה זה אפשרי להשתמש ברצף הדור הבא לזהות את הגנים המועמד הסביר ביותר האחראים לפנוטיפ המזוהה של טפיל מוטציה ^34,38. ללא קשר לגישה mutagenesis, אישור על תפקידו של גן הטפיל בהתנגדות להפעלת מקרופאג סופו של דבר דורש מחיקת גן ושלמה למלא העיקרים של קוך המולקולרי.

היכולת לנתח את הפונקציה של גן על ידי מניפולציה גנטית של שתי הטפיל ומקרופאג חשובה כמו רבים מהגנים שזוהו באמצעות גנטיקה קדימה בט גונדי, כמו גם פתוגנים אחרים, עדיין מאופיינים כגנים היפותטי עם לא מעט הומולוגיה ברצף לחלבונים אחרים עם פונקציות ידועות. המאמר הנוכחי מתאר גישה כללית שיכול לשמש לזיהוי אם הגן המשובש במוטציה הוא חשוב להתנגדות לידועה אומתווך לא ידוע של חסינות אוטונומית תא. הניתוח הראשוני של גורמים אנטי-מיקרוביאלי מארח מתבצע על ידי הערכת ההישרדות של סוג בר וטפילי מוטציה במקרופאגים מעכברים מסוג בר לעומת אלו עם מחיקות גן ספציפיות בsynthase תחמוצת חנקן מושרה, GP-91 phox (מונואמין NADPH) (iNOS), ו GTPases חסינות הקשורים ספציפי (IRGs). זה יקבע אם הגנים הטפיל זיהו חשובים להתנגדות לתחמוצת חנקן, חמצן פעיל ביניים או GTPases חסינות הקשורים ²⁸ בהתאמה, או אם מנגנון חיסוני ידוע הוא מעורב. הפעלה של מקרופאגים הנגועים עם שני IFN-γ וLPS, שתוארו בפרוטוקול הנוכחי, נובעת בעיקר בבידוד של גני הטפיל חשובים להתנגדות לתחמוצת חנקן ^28. השימוש בסוכנים תרופתיים שיגרמו לתחמוצת חנקן בהיעדר הפעלת מקרופאג (תורמי תחמוצת חנקן) אישרו כי הרוב המכריע של הגנים שזוהו היה חשוב למחדשsistance לתחמוצת חנקן ולא תחמוצת חנקן בתיאום עם מתווכים נוספים הקשורות להפעלת מקרופאג ^28.

שלב ראשון ושני לתאר מסך גנטיקה קדימה נועד לבודד מוטנטים טפילים עם פגם כושר לאחר ההפעלה של מקרופאגים נגזרות מח עצם נגוע במבחנה. השלב הראשון מתאר ניתוח טיטרציה מינון כדי לקבוע מינון של γ IFN- וLPS אמפירי לשימוש עבור הפעלת מקרופאג שמפחיתה שכפול טפיל אך לא לעכב את השכפול של ט הסוג בר באופן מלא זן הורים gondii המשמש ליצירת הספרייה של מוטציות טפילה. שלב שני מתאר את המסך הגנטי קדימה של השיבוטים המוטציה במקרופאגים ב96-גם צלחות. שלב שלישי מתאר גישה כדי לאשר את הפנוטיפ של כל מוטציה שזוהתה במסך של 96 הצלחות גם ולהעריך האם הפגם בכל מוטציה משפיע הישרדות טפיל, שכפול,או ייצור ציסטה בתגובה להפעלת מקרופאג. שלב רביעי מתאר את השימוש של מקרופאגים נגזרות מח עצם מעכברים עם מחיקות במסלולי מיקרוביאלית ספציפיות כדי לזהות את המתווכים חיסוניים שמוטצית הטפיל היא במיוחד רגישה. השלב חמישי מתאר גישה כדי לקבוע אם מוטציה טפיל גם התפשרה על הפתוגנזה in vivo כפי שהוערך על ידי ייצור ציסטה במוחם של עכברים נגועים.