JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Способ выбора Структура переключения Аптамеры Применительно к колориметрическим наночастиц золота Пробирной

Published: February 28, 2015
doi:
10.3791/52545
, , , , ,
1711th Human Performance Wing, Human Effectiveness Directorate, Air Force Research Laboratory,Wright-Patterson Air Force Base, 2The Henry M. Jackson Foundation, 3UES, Inc.

Summary

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

Abstract

Малые молекулы обеспечивают богатые цели для биодат- приложений из-за их физиологических последствий в качестве биомаркеров различных аспектов здоровья человека и производительности. Аптамеры нуклеиновых кислот были все более широкое применение в качестве элементов распознавания на биосенсоров платформ, но выбор аптамерами к мелким целям молекул требует специальных конструктивных соображений. Эта работа описывает модификацию и критические этапы способа предназначена для выбора структуры переключения аптамеров малых объектов молекулы. Связывающие последовательности из библиотеки ДНК гибридизуют с комплементарными зондами захвата ДНК на магнитных шариков отделены от nonbinders с помощью изменения целевой индуцированных в конформации. Этот способ является предпочтительным, так как последовательности связывания матрицы носителя (шарики) не будет дополнительно усилен, и это не требует иммобилизации молекулы-мишени. Тем не менее, температура плавления захватывающего зонда, и библиотека хранится в или чуть выше комнатной температуры, например, что последовательности тшлем dehybridize на основе термодинамики также будет присутствовать в надосадочной жидкости. Это эффективно ограничивает эффективность разделения (способность к отдельной цели обязательного последовательности из nonbinders), и, следовательно, многие отборочные туры будут обязаны удалить фоновые последовательности. Сообщил метод отличается от предыдущей структуре переключения аптамеров выборов в связи с реализацией негативных шагов выбора, упрощенной мониторинга обогащения и расширения длины зонда захвата следующей обогащения выбора для обеспечения повышенной жесткости. Выбранной структуры переключения аптамеры выгодно в наночастиц золота анализа платформу, которая показывает наличие молекулы-мишени по конформационного изменения аптамера. Анализ наночастиц золота была применена, потому что он обеспечивает простую и быструю колориметрического считывания, что является полезным в клиническом или развернутой среды. Дизайн и оптимизация соображения представлены для анализа, как доказательство правильности principlе работа в буфер, чтобы обеспечить основу для дальнейшего расширения работы к биодатчиков небольшой молекулы в физиологических жидкостях.

Introduction

Малые молекулы уже давно признаны как играть жизненно важную роль в различных биологических процессах, таких как физиологический токсичности или питания, клеточной сигнализации, а так же фармацевтического лечения к болезням 1. Различные малые молекулы, также были предложены в качестве биомаркеров, указывающих физиологических условий, включая стресс, усталость 2,3 4, и болезни 5. Например, повышенный уровень кортизола коррелируют со стрессом, который может привести к снижению физиологической деятельности и других заболеваний, 6-8. Кроме того, вариации в соотношении отдельных пептидов в слюне прогнозирования усталости, где физиологические проявления включают отсутствие концентрации, нарушение времени реакции и снижение когнитивной функции 4. Таким образом, развитие целевых конкретных биосенсоров для контроля уровня малых молекул может оказать неоценимую метрику для оценки работоспособности и производительности возможностей в экзidual.

Исторически, обнаружение маленькая молекула была выполнена с помощью методов разделения трудоемких или антител основе признания 6,7. Совсем недавно, аптамеры нуклеиновых кислот 9,10 появились в качестве элементов распознавания, которые обладают явными преимуществами над антител в конкретных приложениях. С их способности связываться цель размером от ионов металлов 11 к тканям 12, аптамеры были широко применяются в качестве элементов распознавания в биодат- платформ 13,14. По сравнению с антителами, аптамеры химически синтезированы, и поэтому просто ввести воспроизводимые химические модификации для иммобилизации поверхности или отчетности. Аптамеры может быть выбран с высоким выходным специфики под требуемые условия путем изменения условий выбора, используемые, в то время как антитела ограничены физиологических условиях 15,16. Кроме того, аптамеры способны высокой плотности лиганда за счет йEIR меньший размер, что приводит к повышению эффективности сигнализации цели на платформе биосенсора, а также повысить стабильность аптамеров позволяет для многократного использования и длительного хранения датчика 16.

Аптамеры создаются с помощью процедуры, известной как SELEX, где первоначальный библиотека последовательностей превратилась из 10 13 -10 15 уникальных молекул обогащенного конечного пула, содержащего несколько (10 1 -10 2) последовательности с потенциалом связываться с молекулой-мишенью. Окончательный обогащенный бассейн секвенировали, и константы диссоциации (KD) получают из анализов связывания самых высоких число копий последовательностей с молекулой-мишенью. Эволюция бассейна до конечной обогащенного населения отслеживается путем мониторинга процент бассейна связывания цель в каждом раунде, пока не будет получено максимальное обогащение. Это происходит в течение нескольких эволюционных раундов, где связывающие последовательности отделена от nonbinders и AMPLманьяков с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Способность эффективно разделить и сохранить связующие является одним из основных факторов, определяющих эффективность отбора и непосредственно влияет на характеристики отобранных аптамеров 15. Разделение этап SELEX является более сложным для малых молекул, так как они не обладают размер или различные функциональные группы, которые помогают процессу разделения белковых мишеней 1,15. Например, многие перегородок белок платформы зависят от размера или разделения зарядов на основе, однако свойства связанных ДНК-малая молекула целевых комплексов, как правило, существенно не отличается от таковой необязательные последовательностей, что приводит к неэффективному разделения 1. Альтернативные методы секционирования SELEX может включать в себя иммобилизацию или маркировки цели, которые потенциально могут изменить характеристики связывания малой молекулы. Следовательно, дизайн процедуры отбора для получения аптамеров для малых молекул цели Requires особое внимание.

Разнообразие модификаций были применены к оригинальной методикой SELEX для повышения эффективности разделения процедуры, улучшить сродство или специфичности последовательностей в конечном бассейн, или сделать его более пригодным для различных приложений 15,16. Одна из модификаций SELEX с возможностью выбора для малых молекул была разработана, чтобы произвести структуру коммутации аптамеры, или аптамеров, которые претерпевают конформационные изменения при взаимодействии с молекулой-мишенью 17,18. В одном примере этого метода, библиотека гибридизации с коротким куском необязательный комплементарной ДНК (кДНК), иммобилизованным на магнитных шариков 17. После мишень-связывающий, конформационное изменение связывания последовательностей позволяет им dehybridize из кДНК, выпуская их в надосадочной жидкости, в то время как остальные nonbinders гибридизации с кДНК / гранулы распределяют магнитным и отбрасывают. Этот метод Advantageous для малых молекул, поскольку он не требует иммобилизации или маркировки с молекулой-мишенью, чтобы достичь разделения.

Аптамеры, которые способны структуры коммутации обладают ценной особенностью для любого потенциального биосенсора платформы, которая требует изменений в структуре аптамеров, чтобы обнаружить присутствие молекулы-мишени. В частности, аптамеры могут быть объединены с наночастицами золота (AuNPs) для создания анализов, которые функционируют на основе структуры переключения принципе для получения колориметрический реакции в присутствии молекулы-мишени после солевого вызов 19,20. В анализе AuNP, одноцепочечной ДНК (оцДНК) аптамер первоначально адсорбируются на поверхности AuNP и защищает ее от соли вызов. Наличие мишени индуцирует конформационные изменения в аптамера, что обнажает поверхность AuNP, в результате чего красного к синему изменение цвета следующим добавлением соли. AuNP анализы также показали, чтобы сигнал, в котором мкмоль сродства аптамеров амплификациис может обнаружить цель на уровнях порядка ниже, чем константа диссоциации (KD) 21. Эта функция особенно привлекательным для малых объектов молекулы, где сходство, как правило, в пределах от низкой микромолярных миллимолярных концентрации 1,15. Как правило, анализ также быстрое и относительно прост в исполнении, поощряя дальнейшее изучение аптамер-AuNP анализа, как платформах обнаружения биосенсора.

Целью данной работы является создание универсального протокола для выбора структуры переключения аптамерами малых молекул, для биодат- приложений, использующих стресс маркер кортизола в качестве представителя молекулы. Схема AuNP обнаружения биосенсора представляет интерес из-за своей простоты эксплуатации и колориметрического считывания, но структура переключения аптамеры применимы к альтернативных мероприятий зондирования платформы, такие как электрохимического 22 или флуоресценции 23, что также обеспечивает обнаружение с помощью изменения аптамера conformatioп от цели обязательными. По сравнению с предыдущими методами, несколько негативных шагов отбора были включены в проект 17,18, а просто UV на основе схемы обнаружения обогащение был реализован (рис 1). Этот протокол, в отличие от схемы детектирования обогащения радиолиганда, используемого в старых способов 17. Предлагаемый способ также включены увеличение длины кДНК зондами захвата, используемых в селекции на повышение эффективности разделения и эффективно настроить жесткости отбора после максимальное обогащение наблюдалось 24. Настроены строгость привести к снижению общего процента ДНК элюировали цели в конечном бассейн, но в результате более высоких числа копий последовательности, связанных с повышенным сродством по сравнению с высшей числа копий последовательности от более ранней раунде. Наибольшее число копий последовательности из конечного пула наносили на AuNP анализа, чтобы проиллюстрировать, что последовательность была поддаются платформычто требует структурных изменений, чтобы указать цель обязательными. Этот буфер на основе анализа показывает, что реакция анализа AuNP могут быть изменены путем изменения плотности ДНК наносят на поверхность, и служит доказательством правильности принципа работы посвятить будущие исследовательские усилия в направлении развития малой молекулы аптамеров основе AuNP биосенсоров в физиологические жидкости.

Protocol

1. Библиотека и Primer дизайн и синтез Дизайн начальную библиотеку и праймеров (эта тема уже широко рассматривается в предыдущих публикациях) 25,26. Обобщить следующие последовательности для этого исследования с использованием стандартной химии фосфорамидитную: Библиотека: GAATGGATCCACATCCATGG-N 40 -TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTTGACGAA Прямой праймер: GGAATGGATCCACATCCATGG Обратный праймер: Биотин-AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA Дизайн захват кДНК зонды комплементарны 5'области библиотеки. Выбор начальной длины путем анализа программного обеспечения онлайн температуры плавления, чтобы обеспечить температуру плавления немного выше комнатной температуры, с каждой последующей подачи базе повышенную температуру плавления. Мер Capture Датчик: CCATTCC-биотин Мер Capture Датчик: TCCATTCC-биотин Мер Capture Датчик: ATCCATTCC-биотин Очищают библиотеку с помощью стандартных ВЭЖХ. Обессоливания для недопущения изменениядостаточной для праймеров и захватывающих зондов. Восстановить олигонуклеотидов в нуклеазы свободной воды в нужной концентрации и хранить при температуре -20 ° С в течение нескольких месяцев. 2. Буфер, библиотека и подготовки проб Подготовьте 500 мл буфера в Millipore или нуклеазы без воды класса с концентрацией 50 мМ Трис, 137 мМ NaCl, 5 мМ MgCl 2, рН 7,4. Фильтр буфер через стерильный 0,2 мкм мембрану; хранение возможно в условиях окружающей среды в течение нескольких месяцев. В качестве альтернативы, использовать другие буферы, такие как PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), HEPES (4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота), и т.д. Установите два thermomixers; установить от одного до 95 ° С и держать другой в условиях окружающей среды (~ 20 ° C в этой работе). Подготовка ведерко со льдом. Тепло / оснастки охлаждения библиотеки ДНК путем размещения 100 мкл библиотеки (~ 2,5 нмоль в течение 10 15 -10 16 последовательностей) в термомиксере установитьт 95 ° С в течение 5 мин. Поместите пробирку на льду в то время как магнитные шарики готовы (разделы 3.1-3.6). Определить фактическую концентрацию библиотеки ДНК с помощью УФ-поглощения при λ = 260 нм и применением соответствующего коэффициента пересчета для библиотеки. Подготовить целевой растворы в среде, подходящей для целевого растворимости. Подготовка 100 мМ запасы вещества в ДМСО. Эти запасы являются жизнеспособными примерно в течение 1 месяца при хранении в условиях окружающей среды, но разные цели будут продемонстрировать различные профили деградации. 3. Подготовка магнитных шариков и первый раунд отбора Вихревые 6,7 х 10 8 бусин / мл покрытых стрептавидином магнитных шариков и удалить 400 мкл на новый микроцентрифужных трубки. Поместите пробирку на магнит в течение 2 мин и удалить супернатант. Вымойте бисером, добавив 400 мкл буфера для связывания, вортексирование и аспирации супернатант после размещениятруба на магните, чтобы отделить бусы. Повторите эту процедуру три раза. Зафиксировать захватывающего зонда на магнитных шариков путем ресуспендирования бисером в 400 мкл буфера для связывания с 50 мкМ (конечная) захвата зонда и инкубированием в течение 10 мин при осторожном перемешивании на термосмеситель в условиях окружающей среды. Вымойте бисером трижды с 400 мкл буфера для связывания, повторяя шаги мыть, описанные в разделе 3.2 для удаления свободного зонда захвата. Ресуспендируют бусины в 400 мкл буфера для связывания. Удалить 100 мкл раствора борта для последующих шагов, и сохранить оставшиеся 300 мкл при 4 ° С для использования в дальнейших отборочных туров в течение максимум трех недель. Вымойте бисером дважды с 200 мкл буфера для связывания, как описано в разделе 3.2. Добавьте 100 мкл оснастке охлаждают ДНК из секции 2,3 к промытым шариков и инкубировать в течение 30 мин при осторожном перемешивании с помощью термосмеситель в условиях окружающей среды. NПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации ДНК в первых турах выше, чем у последующих раундов, чтобы свести к минимуму потери последовательности в предыдущих раундах, где представлены уникальные последовательности, теоретически присутствует. Количественного определения ДНК в супернатанте с помощью УФ-поглощения, как и в разделе 2.3, и вычесть это от исходного количества добавленного в разделе 3.7, чтобы оценить количество ДНК, связанный с гранулами. Промыть шарики с 200 мкл буфера с последующим двух дополнительных промывок по 200 мкл буфера при осторожном перемешивании обязательными термомиксер в течение 5 мин при условиях окружающей среды связывания. Ресуспендируют бусины в 200 мкл 100 мкМ цели разбавленных в буфере для связывания, и поворот на термосмеситель течение 30 мин при температуре окружающей среды. Подготовьте рабочие растворы свежего в начале каждого дня до отбора, потому что цель и контроль наблюдались агрегировать из водного раствора с течением времени. Сохранить надосадочную раствор, который содержит последовательность целевого-элюировалис для дальнейшего изучения. Выполните негативный отбор после завершения 1-2 раундов, добавив 200 мкл 1 мкМ прогестерона в гранулы, полученные в разделе 3.8.1. Встряхнуть осторожно в течение 30 мин на термосмеситель в условиях окружающей среды. С помощью магнитного стенд для захвата шарики и отбросить супернатант, промывки гранул дважды в 200 мкл буфера перед кортизола того связывания, что и в разделе 3.9. Мониторинг 4. Обогащение, ПЦР и Однонитевый поколения ДНК Добавить раствора супернатанта с диализной кассеты для мониторинга обогащения выбора. Диализа необходимо удалить кортизола из элюированной ДНК, потому что кортизол присутствует в значительно более высокой концентрации, чем ДНК, а также имеет пик поглощени УФ, что перекрывает стандартной ДНК УФ λ макс = 260 нм. Выполните этот шаг любой другой раунд (раундов 2, 4, 6, и 8) в начале раунда отбора. Это уменьшает пример Los• При потенциально несколько число копий каждой последовательности присутствуют (наибольшее разнообразие). Для более быстрого результата, альтернативные методы, такие как размер столбцов исключение может быть также использованы. Диализировать кассету с образцом в свежих 250 мл буфера для связывания в течение 2 ч в условиях окружающей среды в два раза. Заменить буфер и инкубировать при 4 ° CO / N. Анализ диализуют бассейн с помощью УФ-спектроскопии, чтобы определить процент ДНК элюировали путем мишени (по сравнению с результатами раздела 3.8). Подготовка 3% -ном агарозном геле с 1% вес / объем бромистым этидием. В этой работе, готовить гель с 1,5 г агарозы, 50 мл ТАЕ-буфера (40 мМ Трис-ацетат, 1 мМ ЭДТА, рН = 8,0) и 10 мкл бромистым этидием. Цикл-оптимизации диализуют бассейн путем выполнения небольшого масштаба ПЦР (5 х 50 мкл аликвоты) с помощью ~ 5-15 циклов. Для компонентов ПЦР, используйте 1x реакции ПЦР буфер (все конечные концентрации), 200 мкМ дНТФ, 10% реакционного объема ДНК-матрицы, 500 нМ каждого праймера, и 2,5U-полимеразы (2,5 U / мкл акций). Выполнить ПЦР с использованием оптимизированных условиях при 95 ° С в течение 2 мин с последующими повторными циклами 95 & deg; С (30 сек), 55 & deg; С (30 сек), и 72 ° С (1 мин), а затем 72 ° С (10 мин) окончательное расширение и удерживайте при 4 ° С. Применять 25 б.п. стандартную лестницу для сравнения и визуализировать на геле томографа. Выберите количество циклов, которые производит самый высокий диапазон интенсивности на правильный размер маркера без нежелательных побочных продуктов. Анализ результатов оптимизации цикла путем объединения 10 мкл каждого цикла ПЦР с 2 мкл 6x синий / оранжевый красителем, и загрузка на 5 отдельных скважин 3% агарозном геле, полученного на стадии 4.4 (125 V в течение 45 мин). Выполните масштабную ПЦР с использованием этих условий и соответствующее количество циклов, определенные в разделе 4.5. Обычно 6-8 мл ПЦР-реакций были необходимы для получения 1-2,5 нмоль, используемый для каждого раунда в этом выборе. Используйте 8-полосный трубы, чтобы упроститьобработки из многих труб, необходимых для аликвоту этот объем для ПЦР-амплификации. Подготовьте 3% агарозном геле, как описано в разделе 4.4, и проверить, что группа ПЦР-продукт появляется в правильном месте, следуя шагам разделов 4.5.2-4.5.3. Преобразование весь двухцепочечной ДНК продукт из раздела 4.7 для одноцепочечной ДНК с помощью шагов, описанных ниже: Добавить 300 мкл покрытых стрептавидином бусин (не магнитного) в небольшую колонку заблокирован фритт. Вымойте бисером с 5 мл связывание буфера путем присоединения шприца Луер-Лок и, слегка надавливая на поршень. Извлеките шприц из колонки и удалить поршень из шприца офф-лайн после добавления каждого материала так, что шарики не нарушается плунжера аспирации. Добавить ПЦР-продукта и передать его через колонку с использованием мягкое давление на поршень. Использование нескольких столбцов таким образом, что не более чем 1-1,2 мл ПЦР продукта добавляют в каждую колонку. Откажитесь от окончательного этвл через с ДНК, будут сохранены в столбце по биотин фрагмента на антисмысловой цепью. Промывают колонку 5 мл связывающего буфера. Dehybridize ДНК добавлением 0,5 мл 0,2 М NaOH. Сохранить элюата, как он содержит одноцепочечной ДНК смысл. Обессоливания на оцДНК в 0,2 М NaOH, добавляя 0,5 мл на колонку обессоливания, полученного путем промывки с нуклеазы свободной воды. Откажитесь от первоначального 0,5 мл жидкости, а затем добавить 1 мл нуклеазы свободной воды и собирать эту обессоленной образец оцДНК. Использование нескольких столбцов обессоливания будут необходимы для каждого 0,5 мл части. Определить концентрацию ДНК элюировали путем УФ-поглощению при λ = 260 нм. Вакуумный высушить пробу и восстановить в соответствующем объеме буфера для связывания. Если бы не было достаточно ДНК, полученную в следующий раунд отбора, повторите разделы 4.6-4.9.2. 5. Последующие раундов отбора и последовательности Отрегулируйте строгости условий отбора в зависимости от результатов мониторинга обогащения (раздел 4.1). Как правило, сделать более жесткими условия в последовательных раундах отбора с целью выбора наиболее высокой аффинностью св зующего из пула. Примечание: Это может включать сочетание увеличения концентрации ДНК, увеличение количества, времени, или объем стадий промывки, уменьшения целевой концентрации, увеличение концентрации в отрицательной селекции соединения, или множество других методов 27. Применение надлежащего контроля по мере необходимости, чтобы обеспечить специфичность последовательностей для молекулы-мишени. В этой работе, примените отрицательное молекулу выбора (прогестерон) к системе (таблица 1), начиная с 3-м раунде и увеличением концентрации всей выборки. Начиная с круглым 11, предварительно инкубируют в бассейн ДНК в течение 30 мин с 10-20 мкМ прогестерона до иммобилизации на шариках (до разделе 3.7). </LI> Увеличение длины захвата зонда после наблюдается максимальное обогащение. Подготовка заключительного бассейн (круглый 15) и другие бассейны, представляющий максимально обогащенный (круглый 13) и минимально обогащенных (круглый 6) условия для секвенирования ПЦР-амплификации с совместимых праймеров и высокую точность полимеразы. Настройка громкости 50 мкл реакции с использованием конечных концентраций 1x (реакционный буфер), 200 мкм (каждый дНТФ), 400 нм (каждый праймер), 0,5 мкл бассейн ДНК и 0,5 мкл полимеразы. Цикл оптимизации для каждого раунда, используя шаги, описанные в разделе 4.5, используя те же условия ПЦР, за исключением 7 мин выдерживания при 72 ° С для окончательного расширения. Отправить 50 мкл подготовленных пулов секвенирующем объекта в микропробирок с крышками тщательно запечатаны с неклейкой пленкой. Место труб в 15 мл коническую трубку, наполненную пузырчатую пленку и корабль O / N с пакетами льда до секвенирования объекта. </ol> Определите число копий каждой последовательности, чтобы оценить обогащение секвенированного бассейн (ы). Используйте код-записи / сортировка действия (смотрите дополнительную файл кода) для данных секвенирования следующего поколения в формате FASTA, чтобы определить число частота / копия каждой последовательности повторяются в данных для всех бассейнов, поставляемых для секвенирования объекта: Анализ специфичность и аффинность из самых высоких число копий последовательностей. Тип взаимодействия (белка или малой молекулы), структурных свойств аптамера После связывания и ожидаемой близости будет диктовать, какой метод является целесообразным. Эта тема рассматривается более подробно в ряде публикаций 1,28-30. 6. AuNP Синтез и обнаружение Обобщения AuNPs, используя метод 21 уменьшения цитрат. Смешайте 98 мл воды Millipore с 2 мл 50 мМ HAuCl 4 и нагревают до кипения. Добавьте 10 мл 38,8 мМ цитрат натрия, кактолько начинается отлив. Цвет изменится на красный цвет через несколько минут. Продолжить перемешивания раствора в течение 20 мин с огонь. Разрешить решение AuNP остыть до комнатной температуры затем фильтруют через 0,2 мкм мембраны полиэфира. Храните все суспензий AuNP в темной бутылке янтаря. Рассчитать концентрацию AuNP с помощью УФ-поглощения, с использованием коэффициента экстинкции 2,4 х 10 8 л моль -1 см -1 31. Концентрация была 10 нМ в этой работе, с размером 17 ± 0,6 нм определяется динамический рассеяния света 21. Инкубируйте ДНК с 10 нМ AuNP в течение 1 ч в условиях окружающей среды, защищенных алюминиевой фольги. Вары объем AuNP, чтобы обеспечить достаточно решение, позволяющее все необходимые тесты должны быть выполнены (~ 1-2 мл). Загрузка плотности 73, (молекул ДНК в AuNP) 120 и 200 D / NP были рассмотрены в этой работе, и объем и концентрация будет соответственно меняться. Развести ДНК / решение AuNP 1: 1 с помощью HEPES буфера (20 мМ HEPES, 2 мМ MgCl 2, рН = 7,4). Разрешить смесь уравновешивают при комнатной температуре покрыта алюминиевой фольгой. Примечание: Время, необходимое для этого шага должны быть оптимизированы исследователем. В этой работе, раз от нескольких минут до O / N были исследованы. Подготовка анализируемого (кортизол, желчных кислот, 2-метоксинафталина) растворы на расстоянии 100 мм в ДМСО и накрыть алюминиевой фольгой. Сделайте свежие начальные решения до каждого эксперимента путем разбавления акции до 100 мкм в разведении кортизола связывания буфера (раздел 2.1) 1/3. Кроме того разбавить исходного раствора с 1/3 буфера для связывания, так что постоянного объема (10 мкл) добавляют мишени, чтобы генерировать диапазон концентраций. Оптимизация концентрации соли требуемого добавлением 80 мкл раствора ДНК / AuNP с 10 мкл буфера для связывания 1/3 (именуемый "пустой"). Инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре, то добавлять различные объемы NaCl Solutиона. Посмотрите на объем соли, которая вызывает едва визуально заметное изменение в сторону синего оттенка после добавления соли (13-40 мкл 1 М NaCl, используемой в данной работе). Это обеспечивает хорошую отправную точку, но, возможно, потребуется дополнительная настройка по итогам том числе целевой дополнительно. Зерноуборочный 80 мкл раствора ДНК / AuNP с 10 мкл целевого раствора и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре. Использование 96-луночного планшета и многоканальную пипетку, чтобы проанализировать несколько целевых концентраций одновременно, в том числе всегда пустой (раздел 6.8). Добавить соответствующий объем раствора NaCl (13 мкл 1 М NaCl был применен в данной работе) и сразу же анализируют поглощение при 650 и 530 нм с использованием планшет-ридера. Участок результаты как отношение значений оптической плотности (Е 650 / Е 530) в зависимости от целевой концентрации нормированной по отношению к пустой измерения.

Representative Results

Строгость условий изначально низком уровне, чтобы сохранить связующие, присутствующие в низких числа копий в первые несколько раундов. Первый раунд, в частности, реализованы самые низкие жесткости, чтобы сохранить связующие, как правило, представлены как уникальные последовательности, которые показал высокий кортизол и концентрации ДНК, а также отсутствие негативных шагов выбора. Успех этого отбора аптамеров свидетельствует об эволюции бассейнов с низким процентом элюировали цели (раунд 2) на более высокий фракции элюировали цели, которая остается относительно постоянной в раундах 12-13 (таблица 1). Это плато ДНК элюировали цели традиционно конечной точки при выборе ("обогащения"). Тем не менее, этот способ дополнительно повысило жесткости отбора после обогащения за счет увеличения длины захвата зонда кДНК (рисунок 1). Удлинение этого зонда повышает прочность гибридизации между CDNИ бассейн, повышение температуры плавления (T М) комплекса, и требующие более сильное взаимодействие между мишенью и последовательности, чтобы освободить связывания последовательностей в растворе. Первый раунд отбора осуществляется более слабое взаимодействие кДНК-за один меньше G основания на конце 5'библиотеки. Это в соответствии с более низкими жестких условиях в первом туре, и не ожидается существенного влияния на выбор другой, чем позволяет больше потенциальных связующих, а также фоновые последовательности (dehybridize на основе термодинамики), чтобы перейти к следующему отборочному туру. Эти основные последовательности были сведены к минимуму, как выбор продолжал сторону обогащения за счет реализации более высоких жестких условиях в последующих раундах отбора. Когда кДНК удлинили из 7-мера с 8-мер в круглых 14, процент ДНК элюировали путем мишени уменьшается от 15,3% до 11,1% за Т м увеличилась с 19,2 ° С до 26,7 ° С. КДНК Wкак продлен до 9-Мер в раунде 15 с Т м 31,3 ° C, сбросив общей элюированную до 3,3%. Дополнительная информация по обогащению может быть получено путем секвенирования несколько бассейнов, оба обогащенные и необогащенных примеры для того, чтобы отслеживать прогрессирование бассейнов в каждом раунде. Следующее поколение Секвенирование (NGS) возникла как мощный метод секвенирования в выборе, главным образом потому, что выше последовательность операций чтения (общее количество последовательностей сообщается) получаются по сравнению с Sanger секвенирования. Это выше последовательность читает представить более широкий охват общего числа последовательностей в бассейне, обеспечивая более полную картину разнообразия последовательностей. NGS также удаляет смещение клонирования 32, и позволяет последовательности нескольких бассейнов в одной партии с добавлением штрих-кодов 24,33. NGS был использован для анализа прогрессирования обогащения от трех отдельных бассейнов в этом выборки (рисунок 2). Бассейныот 6 тур (небольшое обогащение по сравнению с 2-м раунде по% элюируют), круглые 13 (высокая обогащения), а вокруг 15 (наивысшей жесткости) были выбраны в качестве репрезентативных точек отбора. Числа копий каждой уникальной последовательности были нанесены в процентах от общего числа последовательности считывает для каждого пула. Самым высоким рейтингом (наибольшее число копия) последовательность составляли только 0,1% всех последовательностей в раунде 6 (33435 тотальных последовательностей, 22463 уникальных последовательностей). Как пул будет максимально обогащенный круглого 13, верхние ранг увеличивается последовательности, содержат 15,4% от всего бассейна (17681 общее последовательности, 2987 уникальных последовательностей), 150x более высокую, чем в раунде 6, несмотря на только ~ 5x увеличением обогащения наблюдаемой с помощью УФ , Круглый 15 (28919 общей последовательности считывает, 2980 уникальных последовательностей) прыгнули на 44,9% из всех последовательностей, представленных в верхнем ранг последовательности одного хотя мониторинг УФ обогащение показали, что количество элюировали мишени был ~ 5x ниже, чем у круглого 13 ( Таблица 1 </strОнг>). Обогащение также свидетельствует низкий процент уникальных последовательностей (67% в туре 6 до 10% в первом раунде 15), а бассейн развивается из многих нескольких последовательностей с потенциальной целью связывания. Кроме того, высокий рейтинг последовательность в круглых 13 (15-3) был третьим самым высоким числом копий последовательности в круглых 15 после того, как кДНК была расширена, а второй занимает последовательность в круглой 13 стал самым последовательность числа копий в круглых 15 (15 -1): 15-1 GGAATGGATCCACATCCATGGATGGGCAATGCGGGGTGGAGAATGGTTGCCGCACTTCGGCTT CACTGCAGACTTGACGAAGCTT 15-3 GGAATGGATCCACATCCATGGGAGGGTTGGAAGGGAGGGGCCCGGGGTGGGCCATCGTTCGTT CACTGCAGACTTGACGAAGCTT Предыдущие исследования изучали связывание этих двух последовательностей микромасштабной термо- и равновесного диализа 24. Результаты показали значительное кортизола обязательными для последовательности 15-1 (K D = 6,9 ± 2,8 мкМ по равновесного диализа, 16,177; 0,6 мкм по микромасштабной ТФ), а минимальный обязательный наблюдалась между кортизола и последовательности 15-3. Это показывает, что увеличение продолжительности захвата зонда в первом раунде 15 оказана помощь в обеспечении более высоких жестких условиях, чтобы разобрать более высокое сродство связующего. Кроме того, ни последовательность продемонстрирована наблюдаемая связывания с молекулой отрицательного отбора, прогестерона, показывающий, что добавление отрицательных шагов отбора было выгодно с процедурой. Тот факт, что более высокое сродство св зующего возникла следующие максимального обогащения (определяемой традиционным методом анализа процент ДНК элюировали путем мишени) после того, как повышенные жесткость условий были применены в дальнейших циклов отбора подтверждает способ увеличения длины захвата кДНК исследовать пост-обогащение. Этот результат показывает, что число копий с секвенированного бассейном и сродством к мишени может быть связано только при определенных условиях 24,34, в конконтраст с предварительного отчета, предполагающий прямую связь 35. В нем также подчеркивается преимущество обогащения мониторинга по NGS, а не исключительно% элюируют общей стратегии в большинстве выборов, которое может изменяться, естественно, от раунда к следующей поскольку более высокие строгие условия применяются. Тем не менее,% элюировали полезно для обогащения мониторинга, когда подобные условия применяются в нескольких раундах. Например, туры 6-10 Все задействованные подобные условия, без существенных изменений в обогащении (таблица 1). Когда это наблюдается в течение нескольких раундов, условия, вероятно, слишком жесткими для продвижения обогащение, и исследователь должен уменьшить строгость в следующем раунде. Например, концентрация кортизола был увеличен с 35 до 100 мкм в раундах 11-13, и элюировали% увеличилась с 2,5% в первом раунде 10 до 14,5%, в круге 12. Поэтому% элюированный может служить в качестве руководства для регулировки Строгость в ходе выбора, когда similAR условия по сравнению с раунда к раунду, и может предоставить дополнительную информацию NGS для определения выбора конечной точки. Последовательность 15-1 наносили на анализе AuNP чтобы определить, является ли последовательность, выбранную таким образом, чтобы произвести структуру коммутации аптамер будет функционировать в анализе, которая опирается на структурные изменения следующей связывания мишени для получения ответа. Предыдущие первоначальные исследования показали, что анализ AuNP с 15-1 ответил на стресс биомаркеров кортизола, но не более двух других маркеров стресса, адреналина и норадреналина, или желчных кислот, маркер заболевания печени структурно подобных кортизола 24. Ответ наблюдался в нормальном диапазоне свободного кортизола сообщалось в сыворотке крови человека (~ 150-600 нм) 6, проверки того, что аптамер выбран для структурных изменений при связывании кортизола приводит ответ в анализе AuNP. В нынешней работе, характеристика системы было принято еще один шаг вперед, регулируяПокрытие (плотность) 15-1 на поверхность AuNP. Используя тот же набор условий, покрытие ДНК была увеличена с 73 D / Np (молекулы ДНК / AuNP), 120 D / NP и 200 D / NP (рисунок 3). Холевой кислоты получают минимальную реакцию, за исключением 10 мкм при 200 D / NP. Ответ анализа сократилось, а охват увеличился как и пределы обнаружения (LOD). LOD составил 29,5 нМ для 73 D / NP, 145,2 нМ для 120 D / NP, и 27,3 мкМ для 200 D / NP. Этот результат согласуется с работой Смит и др., Которые показал, что реакция анализе AuNP использованием кокаина аптамер уменьшается, когда освещение аптамер была увеличена с 60 D / NP 300 D / NP 36. Это означает, что диапазон детектирования для целевого интереса может быть скорректирована на основе оптимизации поверхности покрытия ДНК в пробе AuNP. Это может быть полезным при сравнении, например, диапазон свободного кортизола в сыворотке крови человека (~ 150-600 нм) по сравнению с человеческой слюной (~ 5-25 нМ) <SUP> 6,37. В то время как физиологические жидкости являются гораздо более сложными, чем это буфера для анализа, полученные результаты дают расширение на доказательством правильности принципа работы, показывающие, что условия AuNP может быть скорректирована в зависимости от области применения, и что дальнейшая работа по расширению среды для биологических жидкостей будет интерес к биосенсора сообщества. Рисунок 1. Обзор структуры переключения метода отбора. Маленький биотинилированное зонд захвата кДНК иммобилизуют на покрытых стрептавидином магнитных шариков. КДНК является комплементарной к 5'области библиотеки, библиотеку гибридизации с гранулами. При целевой добавляют, конформационное изменение индуцируется выпустить связывающие последовательности из шарика, что позволяет разделение облегчается путем применения магнита. Супернатант сохраняется для контроля обогащения (% ДНК элюировали ме мишень) УФ после диализа цель из ДНК. Этот шаг необходим, только если молекула-мишень поглощает в то же УФ-диапазоне, ДНК. Последовательности, то ПЦР-амплификации и подготовлены для следующего тура отбора. По мере выбора, негативный отбор применяется, когда последовательности элюировали отрицательного отбора молекулы отбрасываются, и гранулы с потенциальными целевыми связующих затем инкубировали с мишенью. Длина зонда кДНК увеличивается следующих максимального обогащения (%) элюировали повышения жесткости отбора. Эта цифра была перепечатана с разрешения 24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. Круглый [Кортизола] (мкМ) [Прогестерон] (мкМ) Связанные ДНК (пмоль) % Элюировали Target кДНК Длина 1 100 0 357,57 N / 7-Мер 2 50 0 145,49 1,4 7-Мер 3 50 1 188,74 N / 7-Мер 4 50 5 336,4 2,3 7-Мер 5 35 5 88.05 N / 7-Мер 6 35 10 303,89 3,1 7-Мер 7 35 10 255,01 N / 7-Мер 8 35 10 236,81 <TD> 2,1 7-Мер 9 35 10 318,95 2,6 7-Мер 10 35 10 297,18 2,5 7-Мер 11 100 10 147,61 N / 7-Мер 12 100 10 154,36 14,5 7-Мер 13 100 10 150,39 15,3 7-Мер 14 75 20 247,71 11,1 8-Mer 15 50 40 409,63 3,3 9-Мер Таблица 1. прогрессии Выбор и обогащение% элюирования 24 < STRONG>. N / A (Не применяется) сообщается для раунда, где мониторинг диализа / UV обогащение не была выполнена в начале отборочных туров для смягчения потерь низкокопийный числовых последовательностей. Эта таблица была перепечатана с разрешения 24. Рисунок обогащение 2. Выбор определяется следующего поколения секвенирования () Раунд 6.; (Б) 13 Круглый; (C) Круглые 15. Последовательности были ранжированы в соответствии с числа копий. Высокий порядковый номер копии увеличилась с составляющий низкий процент всей секвенированной бассейн в раунде 6 (0,1%) на высокий процент в первом раунде 15 (44,9%), а бассейн был обогащен кортизола связывания последовательностей. Эта цифра была перепечатана с разрешения 24.ET = "_ пустое"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 3. AuNP реакции при испытании с различной аптамер 15-1 покрытие. Плотность аптамера инкубировали с AuNPs был увеличен с 73 D / NP (красный треугольник), 120 D / NP (зеленый квадрат) и 200 D / NP ( синий круг). Ответы кортизола смелые цвета, кислота ответ желчный находится в светлых тонах. Ответ анализ улучшается кортизола при более низких плотностей, тем самым снижая уровень детализации и диапазон цель может быть обнаружена в. Условия с наибольшим ответ кортизола (73 Д / NP) были охарактеризованы в дальнейшем в линейном диапазоне, чтобы обеспечить более точек в пределах ожидаемой нормы свободного кортизола сообщалось в сыворотке крови человека (~ 150-500 нм) и слюны (5-25 нМ ) 6,37. Минимальный ответ из желчных кислот применяя те же 73 D / NP условия имеет бытьEN подробно в предыдущей работе 24. Все участки представляют собой среднее ± SEM для двух или трех повторностях измерений. . Рисунок 4. Представитель Результаты оптимизации ПЦР цикла слева направо скважин представляют собой: 4 циклов, 6 циклов, 8 циклов, 10 циклов 12 циклов отрицательной (без ДНК-матрицы), на 25 б.п. стандартной ДНК лестница. Оптимальные условия наблюдаются на 8 циклов, где одна полоса продукта является при высокой интенсивности, не претендуя на усиление продукции, присутствующих на более высоких циклов. Рисунок 5. AuNP время анализа инкубации оптимизации. Время инкубации на стадии AuNP / ДНК в 73 D / NP была снижена с O / N (фиг.3) до 30 мин, а целевой INCUщение было сразу после добавления соли, а не после 20 мин (рис 3). () Отклик наблюдается кортизола (голубые бриллианты), но не для желчных кислот (зелеными кругами) или 2MNP (2-метоксинафталина, красные квадраты). Все участки представляют собой среднее ± SEM для двух или трех повторностях измерений. (Б) Слева направо: пусто, 10 мкМ кортизола, 10 мкМ холевой кислоты, 10 мкМ 2MNP. Визуальное изменение можно наблюдать невооруженным глазом для кортизола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Discussion

Дело в том, что небольшие молекулы биологического интереса, но только составляют 19% всех аптамеров сообщили оказывает методы, предназначенные для выбора аптамеры, которые применимы к малым молекулам большое значение. SELEX малых молекул является особенно сложной в меньшем количестве функциональных групп, структурных мотивов, и площади поверхности, доступных для взаимодействия с последовательностями по сравнению с белками 1, и было подсчитано, что менее 30% от выборов для всех целей попыток привели к аптамера 38. Поэтому надо быть исключительно в курсе экспериментального проектирования и исполнения для того, чтобы успешно выбрать аптамер к цели малой молекулы.

Способ отбора аптамеров описано в данной работе является предпочтительным, так как он применим к малых молекул, не требуя каких-либо химических изменений, которые могут изменять свои связывающие свойства. Кроме того, элюирование на основе, что означает, что, поскольку тОн ДНК, а не цели, первоначально связаны затем элюировали из магнитных шариков целевой ДНК, взаимодействующих с борта матрицы не будет усилен для следующего раунда отбора, так как связующие в представляющей интерес молекулы попадают в буфере надосадочной и неспецифические матрицы связующие остаются связанными. С другой стороны, метод отрицательного отбора против матрицы требуется для методов, которые иммобилизации цели с твердой подложкой в каждом раунде, потому что ДНК, которая взаимодействует с матрицей будет усилен в дополнение к целевым связующих 1. В настоящее время метод был разработан в качестве T м стратегии ограниченный выбор. Это означает, что Тт / бассейн гибридизации кДНК находиться рядом с РТ. Морзе использовал подобную стратегию, но применили 6-мерный зонд кДНК с Т т <10 ° С с условиями отбора при 4 ° С 17. Наше приложение было в течение биодат- анализа проводили при комнатной температуре, так что длина кДНК была скорректирована в соответствииLY. Это позволяет строгость отбора достаточно низкой, чтобы потенциальные связующие не были потеряны из связывающее взаимодействие цель происходит в удаленном месте, что не вызывает конформационные изменения, способный разрушать кДНК обязательным. Однако эффективность разделения предлагаемого способа является низкой, поскольку некоторые последовательности будет dehybridize исключительно на основе термодинамики. В отличие от этого, Nutiu др. Применили 15-мерный кДНК, и только смогли определить аптамеры для двух из четырех целей, возможно, потому, что Т т от 15-мера была слишком высокой, чтобы позволить выпуск по мишени малой молекулы 18. Таким образом, в то время как нынешняя стратегия выбора потребует много раундов, чтобы удалить фон последовательности, управляя строгость отбора и минимизации потерь потенциальных связующих вероятность успеха будет увеличено.

Многие исследователи новые для отбора аптамеров не знают о важных аспектах, связанных с ПЦРпотенциальные связующие. Оптимизации цикла (раздел 4.5) является необходимым, поскольку чрезмерное усиление библиотек ДНК производит нежелательных побочных продуктов (обычно больше по размеру) при больших числах цикла, и желаемый продукт может полностью исчезнуть с избытком только 5 циклов 39. В случае чрезмерного усиления, продукты ПЦР не представляют эти последовательности элюировали цели, и шансы на успех выбора существенно уменьшаются. Рисунок 4 иллюстрирует пример оптимизации цикла из оцилиндрованного 5 в этой работе. Низкая цикл дает минимальную полосу продукта, группа увеличение количества через 8 циклов; на 10 циклов группа начинает переход на более высокий размер над-амплификации продукта, и почти полностью состоять из более-усиливается продукта в течение 12 циклов. Еще одна деталь, что многие исследователи опыта в SELEX могут не заметить, что весь пул должен быть усилен в масштабной ПЦР-амплификации (раздел 4.6) в еловомго тура, чтобы смягчить потерю связующих. Число уникальных последовательностей олигонуклеотидов возможных из 4 Н, где 4 представляет четырех оснований нуклеиновых кислот, и N есть число оснований в произвольном области библиотеки. Для этой работы, N = 40, в результате чего последовательностей пространстве 1,2 х 10 24 возможных уникальных последовательностей. 2,5 нмоль библиотеки, используемой в первом раунде отбора соответствует ~ 10 15 молекул, это означает, что каждая копия ДНК, скорее всего, представлены в исходном пуле в качестве уникальной последовательности. Таким образом, весь объем ДНК элюировали из бисера цели должен быть усилен, чтобы сохранить копию каждого потенциального связующего для следующего раунда отбора. После того, как эта начальная усиление произошло несколько копий доступны для выбора в следующих раундах, где предполагается гомогенный раствор для отбора проб.

Концентрация цели также должны быть тщательно рассмотрены в каждом раунде. Использование Nutiu и др.Концентрация да 1 мм цели на протяжении всего процесса отбора, а также отдельные АТФ аптамер с K D = 600 мкм 18. И в настоящее время работа и исследования Морса 17 начался с 100 мишени мкМ, снижение на протяжении всего отбора, и в результате аптамеров с низким сродством микромолярных. Какие именно вокруг жесткости должна быть увеличена (низкая концентрация мишень) зависит от того, когда наблюдается обогащение. Еще одним важным шагом является применение надлежащих негативные действия отбора, так аптамеры продемонстрировать специфичность молекулы-мишени. Какие элементы управления используются в контингент от предполагаемого применения выбранного аптамера. Например, аптамер 15-1 был разработан, чтобы функционировать в качестве элемента распознавания в биодат- анализа на кортизола, так что прогестерон был использован в качестве отрицательного отбора молекулы, потому что это метаболический предшественник кортизола, который находится в физиологических жидкостях 40. Аптамер ATP выбран Nutiu и др. </ EM> не включает в себя стадии негативной селекции, и взаимодействует с аналогичной структурой молекул, включая ADP, AMP, аденозин, и дАТФ 18.

Конечная нота для рассмотрения является то, что анализ AuNP часто требует существенной оптимизации для каждого аптамер / целевой пары. Глядя на объем соли, которая вызывает едва визуально заметное изменение в сторону синего оттенка после добавления соли является хорошей отправной точкой, но регулировка отправной точкой может быть обязаны соблюдать ответ. Мы также обнаружили, что анализ дает совершенно разные ответы в зависимости от концентрации буфера (буфера выбор может потребовать разбавления, потому что высокая концентрация соли буферов часто вызывает агрегацию) и состава, степени охвата ДНК (рис 3), подготовки образца (некоторые органические Растворители, используемые для растворения цель может привести к высокой фон, маски отклик от цели), температуру, тип соли и концентрации, и incubaвремя связи (из двух ДНК с AuNP и ДНК / AuNP с мишенью). Под полностью оптимизированных условиях результаты, как правило, наблюдается с временной целевой Инкубационный <5 мин, демонстрируя преимущество быстрого целевой реакции биодат- платформы AuNP. Например, на фиг.5 времени инкубации в аптамера / AuNP шаг был снижен с O / N (рисунок 3) до 30 мин, и соль добавляют сразу (<10 сек), после того целевой вместо 20 мин позже (фиг.3 ) при загрузке плотности 73 D / NP. Это увеличило ответ кортизола до ~ 82% выше, чем заготовки (рис 5а) при концентрации 10 мкМ целевой против ~ 40%, используя вышеуказанные условия (рисунок 3). Этот ответ можно выделить невооруженным глазом (рис 5б). Следует отметить, что линейный диапазон обнаружения кортизола отличается от предыдущих использованием условий, предполагая, что эти условия могут быть оптимизированы для лучшегоДальность обнаружения. Желчный кислота и 2-метоксинафталина (2MNP) контролирует не производят значительное ответ (5А-Б). Исследователи должны знать, что снижение этих времени инкубации может способствовать увеличению ответ аналитов с поверхности AuNP, которые могут способствовать общего расширения сигнала (целевой) или фон (нецелевые молекул). Поэтому особое AuNP дизайн анализ и представление характеристика необходима для каждого аптамер / целевой пары.

Эта процедура описывает протокол для выбора низкомолекулярные структуры коммутации аптамеры, которые функционируют в биодат- платформы, такие как описываемого AuNP анализа, которые требуют конформационное изменение в ДНК, чтобы обнаружить присутствие цели. Тем не менее, этот метод может быть применен к другим системам, таких как биосенсора электрохимических или флуоресценции, которые функционируют на том же помещении практически любого заданного размера. Мощность протокола может получить дальнейшее развитие экспериментальнонесколько подходов. Во-первых, сама выбор может быть потенциально улучшена путем исследования методы оптимизации, такие как определения оптимального Тт в / библиотеки кДНК гибридизации, который обеспечивает взаимодействие, которое является достаточно слабым, чтобы взаимодействовать с целевой малой молекулы, но достаточно сильны, чтобы уменьшить количество фона последовательности dehybridized исключительно из термодинамики. Это будет конденсироваться число тактов, необходимых для выбора, экономя время в труде и снизить расход реагента. Дальнейшие исследования изменений в выборе будет определить наиболее благоприятные концентрации бисера и ДНК так, что многонациональное население последовательностей подвергается цели, особенно в начальный раунд. Успех этих доказательством правильности принципа экспериментов обеспечивают основу для инвестирования дополнительных ресурсов на оптимизацию и адаптацию буфера для анализа AuNP к физиологических жидкостей. Существует обоснованная необходимость для быстрого, надежного биодат- платформа, которая может фуnction в качестве диагностического инструмента физиологического состояния человека и дальнейшего развития анализа AuNP в сыворотке крови человека, пот, или слюна бы встретить этот существующего разрыва.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was performed while the author (JAM) held a National Research Council Research Associateship Award at Air Force Research Laboratories. Co-author MW held a Wright Scholar Fellowship supported by the Air Force Office of Scientific Research. This work was supported by Air Force Office of Scientific Research, Air Force Research Laboratory, and Bio-X Strategic Technology Thrust.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Dynabeads M280 Streptavidin Invitrogen 112.06D Compatible with DynaMag-2 Magnet
DynaMag-2 Magnet Invitrogen 12321D Compatible with Dynabeads M280 Streptavidin
Streptavidin Sepharose High Performance GE Healthcare 17-5113-01 This is a high density streptavidin product for ssDNA preparation
Hydrocortisone Sigma H4001 ≥98%
Progesterone Sigma P0130 ≥99%
Cholic Acid Sigma C1129 ≥98%
NanoDrop ND-1000 NanoDrop ND-1000 Replaced by ND-2000 model
Tris Base Promega H5135 ≥99.9%
Sodium Chloride Sigma S9888 ≥99.5%
Magnesium Chloride Hexahydrate Fluka 63068 ≥98%
500 mL Filter System Corning 430769 0.22 µm cellulose acetate membrane
DNA Library Operon Custom HPLC purified
All other DNA IDT Custom Capture probes and primers- desalted; Aptamers- HPLC
Thermomixer  Eppendorf R Any model with  temperature and mixing speed control will work
PfuUltra II Fusion HotStart DNA Polymerase, 400 rxn Agilent 600674 Taq polymerase can be used as well
Deoxynucleotide Mix, PCR-Grade  Agilent 200415 Other brands will work here
10x Cloned Pfu DNA Polymerase Buffer Agilent 200532 This buffer was optimized for PfuUltra II polymerase
GeneAmp PCR System Applied Biosystems 9700 Any model that allows researcher to open lid for cycle optimization will work
Agarose-LE Ambion AM9040 ≥99.9%
Ethidium Bromide Sigma E-1510 Acute toxicity, inhalation; suspected carcinogen
Empty Synthesis Columns, 1 µm Expedite Style Glen Research 20-0021-01 This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with syringe
Replacement Filters Expedite Glen Research 20-0021-0F 1 µm size
Illustra NAP-25 Columns GE Healthcare 17-0852-01 Any brand with DNA grade resin gel filtration column will work
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette ThermoFisher Scientific 66205 2k MWCO used
Gold(III) chloride hydrate Sigma 254169 99.999% purity is important
Sodium Citrate Dihydrate SAFC W302600 We have found that the compound produced from different manufacturers greatly affects AuNP assays
SpectraMax  Molecular Devices M5 Results were similar to Bio-TEK system
Synergy Bio-TEK HT Results were similar to Molecular Devices system
HEPES Buffer Amresco J848 Any brand that makes a sterilized product will work
250 mL Filter System Corning 430767 0.22 µm cellulose acetate membrane
UV Spectrophophotometer Varian Cary 300  Other brands will work here
5 mL Syringe Becton-Dickinson 309646 This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with Expedite column
ThermoEC Minicell Primo ThermoFisher Scientific EC320 Compatible with Power Supply
Power Supply Fisher Scientific FB300 Compatible with ThermoEC Minicell Primo
Dimethyl Sulfoxide Sigma D8418 Flammable liquid
2 Methoxynaphthalene Sigma 148245 99%
Assay Plate Corning 3370 96-well Flat Bottom, Sterile
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. McKeague, M., DeRosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. J. Nucleic Acids. 2012, 1-20 (2012).
  2. Gatti, R., Antonelli, G., Prearo, M., Spinella, P., Cappellin, E., De Palo, E. F. Cortisol assays and diagnostic laboratory procedures in human biological fluids. Clin. Biochem. 42, 1205-1217 (2009).
  3. Morgan, C. A., Wang, S., Rasmusson, A., Hazlett, G., Anderson, G., Charney, D. S. Relationship among plasma cortisol, catecholamines, neuropeptide Y, and human performance during exposure to uncontrollable stress. Psychosom. Med. 63 (3), 412-422 (2001).
  4. Michael, D. J., Valle, B., Cox, J., Lalns, J. E., Fogt, D. L. Salivary Biomarkers of Physical Fatigue as Markers of Sleep Deprivation. J. Clin. Sleep Med. 9 (12), 1325-1331 (2013).
  5. Kwak, J., et al. Volatile biomarkers from human melanoma cells. J. Chrom. B. 931, 90-96 (2013).
  6. Stevens, R. C., Soelberg, S. D., Near, S., Furlong, C. E. Detection of Cortisol in Saliva with a Flow-Filtered, Portable Surface Plasmon Resonance Biosensor System. Anal. Chem. 80 (17), 6747-6751 (2008).
  7. Arya, S. K., Ghornokur, G., Venugopal, M., Bhansali, S. Antibody functionalized interdigitated μ-electrode (IDμE) based impedimetric cortisol biosensor. Analyst. 135 (8), 1941-1946 (2010).
  8. Kapczinski, F., et al. Allostatic load in bipolar disorder: Implications for pathophysiology and treatment. Neurosci. Biobehav. Rev. 32 (4), 675-692 (2008).
  9. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  10. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  11. Ciesiolka, J., Gorski, J., Yarus, M. Selection of an RNA domain that binds Zn2. RNA. 1 (5), 538-550 (1995).
  12. Liu, J., et al. Selection of Aptamers Specific for Adipose Tissue. PlosOne. 7, e37789 (2012).
  13. McCauley, T. G., Hamaguchi, N., Stanton, M. Aptamer-based biosensor arrays for detection and quantification of biological macromolecules. Anal. Biochem. 319 (2), 244-250 (2003).
  14. Huang, L., et al. A label-free electrochemical biosensor based on a DNA aptamer against codeine. Anal. Chim. Acta. 787, 203-210 (2013).
  15. Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX—A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomol. Eng. 24 (4), 381-403 (2007).
  16. Jayasena, S. D. Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival Antibodies in Diagnostics. Clin Chem. 45 (9), 1628-1650 (1999).
  17. Morse, D. P. Direct selection of RNA beacon aptamers. Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 94-101 (2007).
  18. Nutiu, R., Li, Y. Structure-Switching Signaling Aptamers. J. Am. Chem. Soc. 125 (16), 4771-4778 (2003).
  19. Luo, F., Zheng, L., Chen, S., Cai, Q., Lin, Z., Qiu, B., Chen, G. An aptamer-based fluorescence biosensor for multiplex detection using unmodified gold nanoparticles Chem. Commun. 48 (51), 6387-6389 (2012).
  20. Li, H., Rothberg, L. J. Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction. J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).
  21. Chávez, J. L., MacCuspie, R. I., Stone, M. O., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer–gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response. J. Nanopart. Res. 14 (9), 1166-1177 (2012).
  22. Hagen, J. A., et al. Biofunctionalized Zinc Oxide Field Effect Transistors for Selective Sensing of Riboflavin with Current Modulation. Sensors. 11 (7), 6645-6655 (2011).
  23. Han, K., Liang, Z., Zhou, N. Design Strategies for Aptamer-Based Biosensors. Sensors. 10 (5), 4541-4557 (2010).
  24. Martin, J. A., Chávez, J. L., Chushak, Y., Chapleau, R. R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol. Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).
  25. Hall, B., et al. Synthesis, and Amplification of DNA Pools for In Vitro Selection. Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 39, 9.2.1-9.2.28 (2009).
  26. Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nat. Protoc. 5 (6), 1169-1185 (2010).
  27. Djordjevic, M. SELEX experiments: New prospects, applications and data analysis in inferring regulatory pathways. Biomol. Eng. 24 (2), 179-189 (2007).
  28. Thomas, J. R., Hergenrother, P. J. Targeting RNA with Small Molecules. Chem. Rev. 108 (4), 1171-1224 (2008).
  29. Jing, M., Boswer, M. T. A Review of Methods for Measuring Aptamer-Protein Equilibria. Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-12 (2011).
  30. Sachs, E. -. F., Diederichsen, U. . Binding of Triostin Analogues to DNA. , (2011).
  31. Liu, J., Lu, Y. Preparation of aptamer-linked gold nanoparticle purple aggregates for colorimetric sensing of analytes. Nat. Protoc. 1 (1), 246-252 (2006).
  32. Cho, M., et al. Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (35), 15373-15378 (2010).
  33. Martin, J. A., et al. Selection of an Aptamer Antidote to the Anticoagulant Drug Bivalirudin. Plos One. 8 (3), e57341 (2013).
  34. Schütze, T., et al. Probing the SELEX Process with Next-Generation Sequencing. Plos One. 6 (12), e29604 (2011).
  35. Kupakuwana, G. V., Crill, J. E., McPike, M. P., Borer, P. N. Acyclic identification of aptamers for human alpha-thrombin using over-represented libraries and deep sequencing. Plos One. 6 (5), (2011).
  36. Smith, J. E., Griffin, D. K., Leny, J. K., Hagen, J. A., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field. Talanta. 121, 247-255 (2014).
  37. Chatterton Jr, R. T., Vogelsong, K. M., Lu, Y. -. C., Hudgens, G. A. Hormonal Responses to Psychological Stress in Men Preparing for Skydiving. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82 (8), 2503-2509 (1997).
  38. Gold, L., et al. Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery. Plos One. 5 (12), (2010).
  39. Musheev, M. U., Krylov, S. N. Selection of aptamers by systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Addressing the polymerase chain reaction issue. Anal. Chim. Acta. 564 (1), 91-96 (2006).
  40. Wiebe, J. P. Progesterone metabolites in breast cancer. Endocr.-Relat. Cancer. 13 (3), 717-738 (2006).

Tags

Structure-switching AptamersSmall Molecule TargetsBiosensingGold Nanoparticle AssayNucleic Acid AptamersTarget-induced Conformational ChangeNegative SelectionColorimetric ReadoutPhysiological Fluids

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Martin, J. A., Smith, J. E., Warren, M., Chávez, J. L., Hagen, J. A., Kelley-Loughnane, N. A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay. J. Vis. Exp. (96), e52545, doi:10.3791/52545 (2015).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image