适用于比色金纳米粒子检测方法的选择结构切换适配方法

1.库和引物设计与合成设计的初始库和引物（这个话题已经被广泛审查了以前的出版物）25,26。 合成使用标准的亚磷酰胺化学研究以下序列： 图书馆：GAATGGATCCACATCCATGG-N 40 -TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTTGACGAA 正向引物：GGAATGGATCCACATCCATGG 反向引物：生物素AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA 设计基因捕获探针是互补图书馆的5'区域。选择通过在线熔化温度的软件分析的初始长度，以提供一个熔化温度略高于室温，用每个后续碱供给增加的熔化温度。 滨海捕获探针：CCATTCC生物素滨海捕获探针：TCCATTCC生物素滨海捕获探针：ATCCATTCC生物素净化用标准HPLC库。脱盐sufficient为引物和捕获探针。重建在无核酸酶的水的寡核苷酸在-20℃所需的浓度，并存储长达几个月。 2.缓冲区，图书馆和样品制备制成500毫升之缓冲液中的微孔或无核酸级水以50毫摩尔Tris，137 mM氯化钠，5mM的MgCl 2的，pH为7.4的浓度。过滤通过无菌0.2μm膜的缓冲器;存储能够在环境条件下个月。 可替代地，可使用其它缓冲剂，例如PBS（磷酸盐缓冲盐水），HEPES（4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸） 等。 设置了两个thermomixers;设置1至95℃，并保持其他在环境条件（约20℃，在​​此工作）。准备一个冰桶。 热/管理单元通过将100微升文库冷却该DNA文库（〜2.5纳摩尔为10 15 -10 16个序列），在恒温设定吨95℃下5分钟。将管在冰上而磁性珠粒制备（部分3.1-3.6）。确定由紫外吸收DNA文库中的λ= 260nm处的实际浓度和施加适当的转换因子为库。 在培养基中适当目标溶解度准备目标原液。 准备100毫米分析股票DMSO。这些股票是可行的约1个月储存时在环境条件下，但不同的目标将表现出不同的降解分布。 3.准备磁珠和选择首轮涡旋6.7×10 8珠/ ml的链亲和素包被的磁珠并取出400微升到一个新的离心管中。将管在磁铁2分钟，除去上清液。 加入400微升的结合缓冲液，涡旋，置后吸取上清液洗珠在磁体的管以分离珠。重复此过程三次。 通过再悬浮于400μl的结合缓冲液将小珠用50微米（最终）捕获探针和孵育10分钟，在恒温在环境条件下缓慢搅拌固定于磁珠上的捕获探针。 通过重复在第3.2节以去除游离捕获探针的洗涤步骤洗珠三次400微升结合缓冲液。 重悬珠子在400微升的结合缓冲液。除去将100μl珠子溶液用于下一步骤，并保留剩余的300微升，在4℃用于进一步的选择轮次，最多三个星期。 用200微升作为第3.2节结合缓冲液洗两次珠。 从2.3节中添加100微升卡扣冷却的DNA的洗涤珠子，并使用恒温在环境条件下温育30分钟并轻轻搅拌。 ñOTE：在第一回合中的DNA浓度比随后的几轮，以尽量减少在较早轮次，其中唯一的序列是理论上存在序列损失更高。 定量中使用的紫外线吸收上清液中的DNA为2.3节和3.7节中加入，以评估的DNA结合至珠的量的初始量减去此。 用200μl结合缓冲液，然后用200微升结合缓冲液轻轻搅动在恒温5分钟，在环境条件下两个附加洗涤洗珠。 重悬珠子在200μl的100μM的靶稀释在结合缓冲液，并旋转在恒温30分钟，在环境条件下。制备工作溶液之前选择新鲜在每一天的开始，因为目标和控制观察到聚集的随时间水溶液出来。保留上清溶液含有靶 – 洗脱序列S代表进一步研究。 加入200微升1μM孕酮在3.8.1节准备的珠子执行完成1-2轮后负选择。轻轻摇晃的恒温在环境条件下30分钟。 用磁力架捕获珠子和200微升的结合缓冲液之前，皮质醇除了在第3.9节弃上清，洗珠两次。 4.富集监控，PCR和单链DNA生成上清液溶液添加至透析盒并监控选择富集。透析是必要从洗脱的DNA取出皮质醇因为皮质醇存在高得多的浓度比的DNA，并且还具有UV吸收峰重叠的标准DNA的UVλ 最大 = 260纳米。 执行此步骤每隔轮（轮2，4，6，和8）在前几轮选择。这减轻样品洛杉矶S当每个序列的潜在少数拷贝数存在（最高分集）。对于更快的结果，可替代的方法，例如大小排阻柱可以用作良好。 透析盒与新鲜250毫升的结合缓冲液进行2小时，在环境条件下的两倍的样品。更换缓冲和孵化在4°CO / N。 分析由紫外光谱的透析池，以确定DNA的靶中洗脱的百分比（比较3.8节的结果）。 制备3％的琼脂糖凝胶，用1％w / v的溴化乙锭。在这项工作中，从1.5克琼脂糖，50毫升TAE缓冲液（40毫摩尔Tris醋酸，1mM EDTA中，pH值= 8.0），和10μl溴化乙锭的制备凝胶。 通过利用〜5-15个周期的小规模的PCR（5×50微升等份）周期优化透析池中。对于PCR成分，可以使用1×PCR反应缓冲液（所有终浓度），200μM的dNTPs，DNA模板的10％的反应体积，500nM的各引物，和2.5ü聚合酶（2.5 U /μl的股票）。 运行的PCR使用优化的条件，在95℃进行2分钟，接着是95℃（30秒），55℃（30秒）重复循环，72℃（1分钟），然后72℃（10分钟）最后延伸并保持在4℃。 采用25个基点的标准梯，比较和可视化的凝胶成像仪。选择产生最高强度带在正确的大小标记物，而不不需要的副产物的循环数。 通过组合10微升每个PCR循环与2微升6X蓝/桔样染料，并装载到3％的琼脂糖凝胶在步骤4.4（125 V 45分钟），制备5个独立的孔中进行分析的周期最优化的结果。 进行利用的条件和相应的循环次数在4.5节确定了大规模PCR。通常被要求6-8毫升的PCR反应，以获得1-2.5纳摩尔用于每个轮在此选择。使用8条管，以简化处理所需的许多管子，以等分的该卷PCR扩增。 制备3％的琼脂糖凝胶在部分4.4中描述，并验证该PCR产物带出现在正确的位置下面的部分4.5.2-4.5.3的步骤。 整个双链DNA的产品从4.7节转换成通过下面的步骤进行单链DNA： 添加300微升链霉包被的珠子（没有磁性），以一小柱堵塞筛板。用5ml结合缓冲液通过将路厄锁注射器并施加轻柔的压力，柱塞洗珠。从柱中取出注射器和每增加一个材料之后移除注射器离线柱塞所以珠粒不会被柱塞抽吸干扰。 添加的PCR产物，并通过柱，使用在柱塞温和的压力传递给它。使用，使得不超过1-1.2毫升的PCR产物被加入到每个列数列。放弃最后的FL流通过自该DNA将被保留在由上所述反义链的生物素部分的列。 用5毫升结合缓冲液洗涤该柱。 通过加入0.5ml的0.2M的NaOH Dehybridize该DNA。保留洗脱物，因为它包含的单链正义DNA。 通过加入0.5毫升至通过用不含核酸酶的水洗涤脱盐柱脱盐的ssDNA中的0.2M NaOH中。放弃最初的0.5毫升液，再加入1 ml核酸免费的水和收集这些脱盐单链DNA样本。将需要对每个0.5毫升部使用多个脱盐柱。 确定的DNA在λ= 260nm处洗脱通过紫外吸收的浓度。 真空干燥该样品和重组中的结合缓冲液的适当体积。当然，如果没有为下一轮选择得到足够的DNA，重复部分4.6-4.9.2。 选择和排序5.随后的几轮调整取决于富集监测（4.1节）的结果的选择的条件的严格性。一般地，使条件在连续几轮选择更严格，以便从池中选择的最高亲和力的粘合剂。 注意：这可能涉及增加的DNA浓度，增加的数量，时间，或在洗涤步骤体积，降低靶浓度的组合，提高了负选择化合物的浓度，或各种其他方法27。 应用适当的控制适当，以保证用于目标分子的序列的特异性。在这项工作中，施加负选择分子（孕酮）至系统（ 表1）开始第3轮和中浓度在整个选择增加。在开始11轮，预孵化池DNA为30分钟，10〜20微米的孕激素之前，固定在珠（​​第3.7节之前）。 </LI> 增加捕获探针的长度后最大富集是观察。 准备最后的游泳池（15轮）和其他代表池测序最大限度地丰富（13轮）和微创丰富（第6轮）的条件下通过PCR扩增兼容引物和高保真聚合酶。 设置一个50μl的反应体积中使用终浓度1×（反应缓冲液）中，200μM（每种dNTP），400纳米（各引物），0.5微升的DNA池，和0.5微升聚合酶。周期优化每一轮使用使用相同的PCR条件，除了一个7分钟保持在72℃最终延伸在4.5节中概述的步骤。 送50微升制备的池来测序设施在微量离心管中与盖与非粘合剂包裹彻底密封。将管在一个15毫升的锥形管挤满了泡沫包装和船舶O / N用冰袋来测序设施。 </ol> 确定每个序列的拷贝数来评估排序池（S）的富集。 使用代码编写/整理FASTA格式的步骤（见补充代码文件）的新一代测序数据，以确定每个序列中由测序设备提供的所有池的数据重复的频率/拷贝数： 分析的最高拷贝数序列的特异性和亲和力。相互作用（蛋白质或小分子），所述适体结合后的结构性能，以及预期的亲和力的类型将决定哪一种方法是适当的。本主题中进一步详细审查了一些参考1,28-30中。 6.金纳米粒子合成与检测使用合成柠檬酸还原法21金纳米粒子。混合98毫升的微孔水用2ml 50mM的氯金酸水溶液，并加热至沸腾。 加入10毫升38.8 mM柠檬酸钠作为一旦开始回流。几分钟后颜色会变成红色。继续搅拌该溶液20分钟以热关闭。 允许金纳米粒子溶液通过0.2微米的聚酯膜冷却至室温，然后进行过滤。存储所有的金纳米粒子悬浮在一个黑暗的琥珀色瓶子。 计算金纳米粒子浓度通过UV吸收，利用2.4×10 8升摩尔-1 -1 31中的消光系数。浓度为10nM的在这项工作中，为17±0.6纳米的尺寸通过动态光散射21来确定。 孵育用10nM金纳米粒子DNA的1小时在由铝箔保护环境条件。而变化金纳米粒子的体积，以提供足够的溶液以使将要执行所有所需的测试（〜1-2毫升）中。 73，120，和200的D / NP（每金纳米粒子的DNA分子）装载密度进行了检查在这项工作中，而且体积和浓度会相应地变化。 使用HEP 1：稀释DNA /金纳米粒子溶液1ES缓冲液（20mM HEPES，2mM的MgCl 2的，pH值= 7.4）。使混合物平衡在室温覆盖铝箔。 注：该步骤所需的时间将需要由研究人员进行优化。在这项工作中，时间范围从几分钟到O / N进行了调查。 制备分析物（皮质醇，胆酸，2-甲氧基萘）储备溶液在100毫在DMSO中并覆盖有铝箔。做出新的初始解决方案之前，每个实验稀释股票为100微米的1/3稀释皮质醇结合缓冲液（2.1节）的。进一步稀释1/3的结合缓冲液的初始解，使得靶的恒定体积（10微升）加入到生成的范围内的浓度。 优化通过加入80微升的DNA /金纳米粒子溶液与10微升的1/3结合缓冲液所需要的盐浓度（称为“空白”）。 孵育20分钟，在RT下再加入不同体积的NaCl SOLUT的离子。寻找盐诱导勉强视觉上明显朝着加入盐（13-40微升1 M氯化钠在这项工作中使用）后，一个蓝色的色调变化量。这提供了一个很好的起点，但可能需要进一步的调整后的结果，包括目标添加。 结合80微升的DNA /金纳米粒子溶液与10微升靶溶液孵育20分钟，在室温。利用96孔板和多道移液器同时分析多个目标浓度，总是包括空（第6.8节）。 添加的NaCl溶液适当体积（13微升1M NaCl的是在这项工作中使用），并立即用酶标仪分析的吸光度在650和530纳米。 绘制结果作为吸光度值与目标浓度标准化相对空白测量的比例（E 650 / E 530）。