منهج في اختيار الأبتامرات تبديل الهيكل تطبيقها على اللونية الذهب جسيمات متناهية الصغر الفحص
Summary
A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.
Abstract
توفر جزيئات صغيرة أهداف غنية لتطبيقات biosensing بسبب آثارها الفسيولوجية على النحو المؤشرات الحيوية لمختلف جوانب صحة الإنسان والأداء. وقد طبقت الأبتامرات الحمض النووي على نحو متزايد مع عناصر الاعتراف على منصات جهاز الاستشعار البيولوجي، ولكن اختيار الأبتامرات نحو أهداف جزيء صغير يتطلب اعتبارات التصميم الخاصة. يصف هذا العمل تعديل والخطوات الحاسمة لطريقة تصميم لتحديد الأبتامرات تبديل الهيكل لأهداف جزيء صغير. يتم فصل ملزم متواليات من مكتبة DNA تهجين لتحقيقات تكميلية التقاط DNA على حبات مغناطيسية من nonbinders عن طريق التغير بفعل هدف في التشكل. هذا الأسلوب هو مفيد لتسلسل ملزمة مصفوفة دعم (الخرز) لن يتم زيادة تضخيمها، وأنها لا تتطلب الشلل في جزيء الهدف. ومع ذلك، يتم الإبقاء على حرارة ذوبان القبض على التحقيق ومكتبة عند أو أعلى قليلا RT، مثل أن متواليات روقبعة dehybridize على أساس الديناميكا الحرارية يكون حاضرا أيضا في حل طاف. وهذا يحد بشكل فعال كفاءة التقسيم (القدرة على الهدف منفصل متواليات من nonbinders ملزمة)، وسوف تكون هناك حاجة لذلك العديد من جولات اختيار لإزالة متواليات الخلفية. يختلف أسلوب ذكرت من التحديدات السابقة أبتمر تبديل هيكل بسبب تنفيذ خطوات اختيار السلبية، ورصد تخصيب مبسطة، وتمديد طول القبض على التحقيق التالية تخصيب التحديد إلى توفير وتعزيز صرامة. والأبتامرات تبديل هيكل المختارة هي مفيدة في منصة فحص جسيمات متناهية الصغر الذهب التي تفيد وجود جزيء الهدف من التغيير متعلق بتكوين لأبتمر. تم تطبيق فحص جسيمات متناهية الصغر من الذهب لأنه يوفر لذلك، قراءات اللونية السريعة البسيطة التي تعود بالنفع في بيئة السريرية أو نشرها. يتم عرض تصميم والأمثل اعتبارات للمقايسة كما إثبات صحة المبادئ الشخصيهالعمل الإلكترونية في عازلة لتوفير أساس لمزيد من تمديد عمل نحو biosensing جزيء صغير في السوائل الفسيولوجية.
Introduction
منذ فترة طويلة المعترف بها جزيئات صغيرة مثل لعب الأدوار الحيوية في العمليات البيولوجية المختلفة مثل سمية الفسيولوجية أو التغذية، وإشارات الخلية، والعلاجات الدوائية لمرض 1. كما تم اقترح جزيئات صغيرة مختلفة، والمؤشرات الحيوية تدل على الظروف الفسيولوجية بما في ذلك التوتر 2،3، والتعب 4، والمرض 5. على سبيل المثال، ومستويات الكورتيزول المرتفعة ترتبط مع التوتر الذي قد يؤدي إلى انخفاض الأداء الفسيولوجي والشروط الصحية الأخرى 6-8. وبالمثل، والاختلافات في نسب بعض الببتيدات في اللعاب هي التنبؤية التعب، حيث تشمل المظاهر الفسيولوجية عدم القدرة على التركيز، وضعف وقت رد الفعل، وانخفاض وظيفة الادراك 4. ولذلك، فإن تطوير أجهزة الاستشعار الهدف محددة لمراقبة مستويات الجزيئات الصغيرة قد توفر متري لا يقدر بثمن لتقييم قدرات الصحة والأداء من السرعة الكلاسيكي فرديidual.
تاريخيا، وقد تم تنفيذ الكشف عن جزيء صغير من خلال تقنيات فصل كثيفة العمالة أو عن طريق الأجسام المضادة الاعتراف استنادا 6،7. وفي الآونة الأخيرة، الأبتامرات الحمض النووي 9،10 ظهرت كعناصر الاعتراف بأن تمتلك مزايا واضحة على الأجسام المضادة في تطبيقات محددة. مع قدرتها على ربط هدف متفاوتة في حجمها من ايونات المعادن 11 إلى 12 الأنسجة، وقد طبقت على نطاق واسع الأبتامرات كعناصر الاعتراف في منصات biosensing 13،14. مقارنة مع الأجسام المضادة، وتوليفها كيميائيا الأبتامرات، ولذلك فمن بسيط لإدخال التعديلات الكيميائية استنساخه لتجميد سطح أو التقارير. يمكن اختيار الأبتامرات مع خصوصية هدف عالية وفقا للشروط المطلوبة عن طريق تعديل شروط الاختيار المستخدمة، في حين أن الأجسام المضادة تقتصر على الظروف الفسيولوجية 15،16. وبالإضافة إلى ذلك، الأبتامرات قادرة على أعلى كثافة يجند بسبب إلى thمجلة إكزكتف إنتلجنس ريفيو حجم أصغر، مما أدى إلى هدف أعلى مما يشير إلى كفاءة على منصة جهاز الاستشعار البيولوجي، وتعزيز الاستقرار من الأبتامرات يسمح للاستخدام المتكرر والتخزين استشعار طويلة الأجل 16.
يتم إنشاء الأبتامرات باستخدام إجراء يعرف باسم SELEX، حيث يتم تطورت مكتبة الأولية من متواليات من 10 13 -10 15 جزيئات فريدة من نوعها لحمام سباحة النهائي المخصب تحتوي على عدة (10 -10 1 2) متواليات مع القدرة على ربط جزيء الهدف. ثم يتم التسلسل بركة المخصب النهائي، ويتم الحصول على ثوابت التفكك (K د) من المقايسات من أعلى تسلسل عدد النسخ ملزم مع جزيء الهدف. وتتبع تطور تجمع للسكان النهائي المخصب من خلال رصد النسبة المئوية للتجمع ملزمة هدف في كل جولة، حتى يتم الحصول على تخصيب القصوى. ويحدث هذا على مدى عدد من جولات التطورية، حيث يتم تقسيم تسلسل ملزمة من nonbinders وAMPLified باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). القدرة على تقسيم فعال والاحتفاظ المجلدات هي واحدة من المحددات الرئيسية للكفاءة الآثار الاختيار ومباشرة خصائص الأبتامرات اختيار 15. مرحلة التقسيم SELEX هي أكثر تحديا لجزيئات صغيرة لأنها لا تمتلك حجم أو مجموعة من المجموعات الوظيفية التي تساعد عملية التقسيم من الأهداف بروتين 1،15. على سبيل المثال، العديد من المنصات البروتين تقسيم تعتمد على حجم أو الانفصال على أساس تهمة، لكن خصائص المربوطة المجمعات الهدف جزيء الحمض النووي صغير عموما لا تختلف بكثير من تسلسل غير ملزمة، مما أدى إلى تقسيم غير فعالة 1. طرق تقسيم SELEX البديلة قد تنطوي على تجميد أو وضع العلامات من الهدف، والتي يحتمل أن يغير خصائص ملزم من جزيء صغير. وبالتالي، تصميم إجراءات الاختيار لتوليد الأبتامرات لجزيء صغير يستهدف صequires اهتماما خاصا.
تم تطبيق مجموعة متنوعة من التعديلات على منهجية SELEX الأصلية لتعزيز كفاءة تقسيم الإجراء، وتحسين تقارب أو خصوصية متواليات في التجمع النهائي، أو جعلها أكثر قابلية لتطبيقات مختلفة 15،16. وقد تم تصميم واحد تعديل SELEX قادر على اختيار لجزيئات صغيرة لتوليد الأبتامرات تبديل بنية، أو الأبتامرات أن يخضع لعملية تغيير متعلق بتكوين على التفاعل مع جزيء الهدف 17،18. في مثال واحد من هذه الطريقة، يتم تهجين المكتبة إلى قطعة قصيرة من الحمض النووي مكملة غير ملزم ([كدنا]) ثبتوا على حبات مغناطيسية 17. على ملزما الهدف، فإن التغيير متعلق بتكوين سلاسل ملزمة تمكنهم من dehybridize من [كدنا]، الإفراج عنهم في حل طاف، في حين أن nonbinders المتبقية تهجين إلى كدنا] / والخرز تقسيم مغناطيسيا والتخلص منها. هذا الأسلوب هو يمضيtageous لجزيئات صغيرة لأنها لا تتطلب تجميد أو وضع العلامات من الجزيء المستهدف لتحقيق الانفصال.
الأبتامرات التي هي قادرة على هيكل التبديل تمتلك ميزة قيمة لأي منصة جهاز الاستشعار البيولوجي المحتملة التي يتطلب تغييرا في بنية أبتمر للكشف عن وجود جزيء الهدف. على وجه التحديد، الأبتامرات يمكن الجمع بين جزيئات الذهب (AuNPs) لإنشاء المقايسات التي تعمل على أساس مبدأ تبديل بنية لإنتاج استجابة اللونية في وجود جزيء الهدف بعد التحدي الملح 19،20. في مقايسة AuNP، وDNA واحد الذين تقطعت بهم السبل (ssDNA) أبتمر تمتز في البداية إلى السطح AuNP ويحميها من التحدي الملح. وجود هدف يؤدي الى تغيير متعلق بتكوين في أبتمر الذي يعرض سطح AuNP، مما أدى إلى تغيير اللون الأحمر إلى اللون الأزرق-بعد إضافة الملح. وقد تبين أيضا AuNP المقايسات لتضخيم الإشارات، حيث مكرومولي تقارب أبتمرالصورة يمكن الكشف عن الهدف في مستويات أوامر من حجم أقل من ثابت التفكك (K د) 21. هذه الميزة هي جاذبية خاصة للأهداف جزيء صغير، حيث تتراوح الانتماءات عادة من انخفاض مكرومولي لتركيزات millimolar 1،15. عموما، فإن الاختبار هو أيضا سريع وبسيط نسبيا لأداء وتشجيع مزيد من الدراسة من المقايسات أبتمر-AuNP كمنصات كشف جهاز الاستشعار البيولوجي.
والهدف من هذا العمل هو توفير بروتوكول عالمي لاختيار الأبتامرات تبديل هيكل إلى جزيئات صغيرة لتطبيقات biosensing باستخدام الكورتيزول الإجهاد علامة كناقل تمثيلي. مخطط AuNP كشف جهاز الاستشعار البيولوجي هو من مصلحة نظرا لبساطته التشغيل وقراءات اللونية، ولكن الأبتامرات تبديل بنية قابلة للتطبيق على مخرجات منصة الاستشعار البديلة، مثل الكهروكيميائية 22 أو 23 مضان التي توفر أيضا كشف عن طريق تغيير في أبتمر conformatioن على هدف ملزم. بالمقارنة مع الطرق السابقة، وأدرجت عدة خطوات اختيار السلبية في تصميم 17،18، ونفذت خطة الكشف تخصيب القائم على الأشعة فوق البنفسجية بسيط (الشكل 1). هذا البروتوكول هو في تناقض مع نظام الكشف عن تخصيب جين مشع يستخدم في الطرق القديمة 17. كما أدرجت الطريقة المقترحة زيادة في طول المجسات التقاط [كدنا المستخدمة في اختيار لزيادة كفاءة وفعالية تقسيم ضبط التشدد في اختيار بعد لوحظ تخصيب القصوى 24. أدى الرصاص صرامة ضبطها إلى النسبة الإجمالية أقل من الحمض النووي مزال بواسطة هدف في التجمع النهائي، ولكن بأعداد نسخة أعلى من سلسلة التي تربط مع تعزيز التقارب مقارنة بأعلى نسخة تسلسل عدد من جولة سابقة. تم تطبيق أعلى نسخة تسلسل عدد من التجمع النهائي لمقايسة AuNP لتوضيح أن تسلسل كان قابلة للمنصةيتطلب التغيير الهيكلي للإشارة إلى هدف ملزم. ويظهر هذا الاختبار عازلة على أساس أن الاستجابة للمقايسة AuNP يمكن تعديلها عن طريق تغيير كثافة DNA تطبيقها على السطح، وبمثابة إثبات لمبدأ العمل على تكريس الجهود البحثية المستقبلية نحو تطوير جزيء صغير القائم على أبتمر أجهزة الاستشعار AuNP في السوائل الفسيولوجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
حقيقة أن جزيئات صغيرة ذات أهمية بيولوجية، ولكن تشكل فقط 19٪ من جميع الأبتامرات ذكرت يجعل طرق مصممة لاختيار الأبتامرات التي تنطبق على جزيئات صغيرة من أهمية كبيرة. SELEX من جزيئات صغيرة تحديا خاصا كجماعات وظيفية أقل، زخارف الهيكلية، ومساحة السطح المتاحة للتفاعل مع تسلسل مقارنة مع البروتينات 1، وتشير التقديرات إلى أن أقل من 30٪ من الاختيارات لجميع الأهداف حاول قد أدت إلى أبتمر 38. ولذلك، يجب على المرء أن يكون على علم بشكل استثنائي من التصميم التجريبي والتنفيذ من أجل تحديد أبتمر إلى هدف جزيء صغير بنجاح.
طريقة اختيار أبتمر وصفها في هذا العمل هو مفيد لأنه ينطبق على جزيئات صغيرة دون الحاجة إلى أي تعديل الكيميائية التي قد تغير خصائص ملزم بها. بل هو أيضا شطف مقرها، مما يعني أنه منذ رانه DNA، بدلا من الهدف، لا بد في البداية ثم مزال من حبات مغناطيسية بواسطة هدف، لن يتم تضخيم DNA التفاعل مع مصفوفة حبة للجولة المقبلة من التحديد لأن يتم الإفراج المجلدات إلى جزيء من الفائدة في المخزن المؤقت طاف والمغلفات مصفوفة غير محددة تبقى مع ذلك ملتزمة. على العكس من ذلك، لا بد من طريقة سلبية للاختيار ضد مصفوفة لالأساليب التي لشل حركة الهدف إلى دعم قوي كل جولة لDNA التي تتفاعل مع المصفوفة سوف تتضخم بالإضافة إلى المجلدات الهدف 1. وقد تم تصميم الطريقة الحالية باعتبارها استراتيجية مجموعة محدودة T م. وهذا يعني أن T م لل/ تجمع تهجين [كدنا أبقي بالقرب من RT. تستخدم مورس استراتيجية مماثلة، ولكن تطبيق [كدنا التحقيق 6 مير مع T م <10 ° C مع شروط الاختيار في 4 ° C 17. كان تطبيقنا للمقايسة biosensing أجريت في RT، لذلك تم تعديل طول كدنا] وفقالاي. هذا يحافظ على التشدد في اختيار منخفضة بما فيه الكفاية بحيث لا تضيع المجلدات المحتملة لأن التفاعل ملزمة الهدف يحدث في مكان بعيد أن لا يسبب تغيير متعلق بتكوين قادرة على تعطيل كدنا] ملزمة. ومع ذلك، فإن كفاءة تقسيم الطريقة المقترحة منخفضة لأن بعض متواليات سوف dehybridize تستند فقط على الديناميكا الحرارية. في المقابل، Nutiu وآخرون تطبيق [كدنا 15 مير، وكانت فقط قادرة على تحديد الأبتامرات لاثنين من الاهداف الاربعة، ربما لأن T م من مير 15 كان مرتفعا جدا للسماح بيان من هدف جزيء صغير 18. لذلك، في حين أن استراتيجية التحديد الحالي سيتطلب عدة جولات لإزالة متواليات الخلفية، من خلال التحكم في التشدد في اختيار والتقليل من فقدان المواد الرابطة المحتملة سيتم زيادة احتمالات النجاح.
العديد من الباحثين جديد لاختيار أبتمر لا يدركون من الجوانب الهامة المتعلقة PCR منتجليد المحتملة. دورة الأمثل (القسم 4.5) ضروري لأن الإفراط في تضخيم المكتبات DNA ينتج غير المرغوب فيها من المنتجات (عادة أكبر في الحجم) في دورة أرقام عالية، والمنتج المطلوب قد تختفي تماما مع وجود فائض من فقط 5 دورات 39. في حالة الإفراط في تضخيم، والمنتجات PCR لم تعد تمثل تلك متواليات مزال بواسطة هدف، وتتناقص فرص النجاح الاختيار بشكل كبير. الشكل 4 يوضح مثالا للدورة الأمثل من الجولة 5 في هذا العمل. أدنى دورة تنتج الحد الأدنى من الفرقة المنتج، وزيادة الفرقة في كمية من خلال 8 دورات، في 10 دورات الفرقة تبدأ الانتقال إلى أعلى حجم الإفراط في تضخيم المنتج، وتضم ما يقرب تماما من المنتج تضخيمها عبر غضون 12 دورات. تفاصيل أخرى أن العديد من الباحثين عديم الخبرة في SELEX قد نغفل هو أن تجمع بأكمله يجب تضخيمه في PCR التضخيم على نطاق واسع (القسم 4.6) في التنوبالحادي جولة للتخفيف من فقدان المواد اللاصقة. عدد متواليات فريدة الممكنة من [أليغنوكليوتيد هو 4 N، حيث يمثل 4 أربع قواعد الحمض النووي، وN هو عدد القواعد في المنطقة عشوائية من المكتبة. لهذا العمل، N = 40، مما أدى إلى الفضاء متواليات من 1.2 × 10 24 متواليات فريدة الممكنة. 2.5 نانومول من مكتبة المستخدمة في الجولة الأولى من اختيار يتوافق مع ~ 10 15 الجزيئات، وهذا يعني أن كل نسخة من الحمض النووي من المرجح ممثلة في التجمع الأولي باعتباره تسلسل فريد من نوعه. ولذلك، يجب تضخيم حجم كامل من الحمض النووي مزال من الخرز بواسطة هدف في الاحتفاظ بنسخة من كل الموثق المحتملين للجولة القادمة من الاختيار. وبمجرد حدوث هذا التضخيم الأولي، هي متاحة للاختيار في الجولات التالية حيث يفترض حلا متجانسا لأخذ العينات نسخ متعددة.
وينبغي أيضا النظر تركيز الهدف بعناية في كل جولة. Nutiu آخرون استخدامتركيز دا من 1 ملي هدف في جميع مراحل عملية الاختيار، واختيار لأبتمر ATP مع K د = 600 ميكرومتر 18. بدأ كل من العمل الحالي والبحوث مورس 17 مع 100 هدفا ميكرومتر، وخفض طوال التحديد، وأسفرت عن الأبتامرات مع الانتماءات مكرومولي منخفضة. بالضبط الذي جولة التشدد ينبغي زيادة (أقل تركيز الهدف) يعتمد على عندما لوحظ تخصيب اليورانيوم. خطوة حاسمة أخرى تتمثل في تطبيق الخطوات المناسبة اختيار السلبية لذلك الأبتامرات تثبت خصوصية لجزيء الهدف. التي تستخدم فيها الضوابط يتوقف على مدى تطبيق المقصود من أبتمر المحدد. على سبيل المثال، تم تصميم أبتمر 15-1 لتكون بمثابة عنصر الاعتراف في مقايسة biosensing لالكورتيزول، لذلك تم استخدام هرمون البروجسترون كما جزيء اختيار سلبي لأنه هو مقدمة الأيضي لالكورتيزول التي وجدت في السوائل الفسيولوجية 40. وأبتمر ATP التي اختارها Nutiu وآخرون. </ م> لم تتضمن خطوة اختيار السلبية، ويتفاعل مع جزيئات مماثلة بنيويا بما في ذلك ADP، AMP، الأدينوزين، وdATP 18.
ملاحظة أخيرة للنظر هو أن الفحص AuNP غالبا ما يتطلب تحسين كبير لكل زوج أبتمر / الهدف. أبحث عن حجم الملح الذي يسبب تغير بالكاد بصريا نحو ونه الازرق بعد إضافة الملح هو نقطة انطلاق جيدة، ولكن قد تكون هناك حاجة لتعديل نقطة انطلاق لاحظت استجابة. لقد وجدنا أيضا أن فحص تنتج استجابات مختلفة بشكل كبير اعتمادا على تركيز عازلة (قد يتطلب عازلة اختيار التخفيف لأن تركيز الملح عال من مخازن وغالبا ما يسبب تجميع) وتكوينها، ودرجة التغطية DNA (الشكل 3)، وإعداد العينات (بعض العضوية المذيبات المستخدمة لإذابة الهدف قد يسبب خلفية عالية أن الأقنعة تستهدف الاستجابة)، ودرجة الحرارة، نوع الملح والتركيز، وincubaالوقت نشوئها (من كل من الحمض النووي DNA مع AuNP و/ AuNP مع الهدف). في ظل ظروف الأمثل تماما، وعادة ما تكون لاحظت النتائج مع فترة حضانة الهدف <5 دقائق، مما يدل على الاستفادة من وجود استجابة الهدف السريع للمنصة biosensing AuNP. على سبيل المثال، في الشكل 5 فترة حضانة من أبتمر / تم تخفيض AuNP خطوة من O / N (الشكل 3) لمدة 30 دقيقة، وتمت إضافة الملح على الفور (<10 ثانية) بعد إضافة الهدف بدلا من 20 دقيقة في وقت لاحق (الشكل 3 ) في مناطق ذات كثافة تحميل 73 D / NP. هذه الزيادة في استجابة الكورتيزول إلى ~ أعلى 82٪ من فارغة (الشكل 5A) في تركيز 10 ميكرومتر هدف مقابل ~ 40٪ باستخدام الشروط السابقة (الشكل 3). هذا الرد يمكن تمييزها بالعين المجردة (الشكل 5B). لاحظ أن مجموعة خطية من الكشف الكورتيزول هو مختلف من استخدام الشروط السابقة، مما يشير إلى أن هذه الظروف يمكن أن يكون الأمثل لالمطلوباكتشاف مجموعة. لم حمض الكوليك و2-methoxynaphthalene (2MNP) الضوابط لا تنتج استجابة كبيرة (أرقام 5A-B). يجب أن يكون الباحثون على علم بأن الحد من هذه الأوقات حضانة قد تسهل استجابة متزايدة من التحاليل مع سطح AuNP، والتي يمكن أن تسهم في إشارة الشاملة محسن (الهدف) أو الخلفية (جزيئات غير المستهدفة). ولذلك، دقيق AuNP تصميم فحص والأداء توصيف ضروري لكل زوج أبتمر / الهدف.
يصف هذا الإجراء بروتوكول لاختيار الأبتامرات صغيرة جزيء تبديل هيكل التي تعمل في منصة biosensing مثل AuNP فحص وصفها، والتي تتطلب تغيير متعلق بتكوين من الحمض النووي للكشف عن وجود الهدف. ومع ذلك، وهذه الطريقة يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى مثل جهاز الاستشعار البيولوجي الكهروكيميائية أو مضان التي تعمل على نفس المبدأ تقريبا لحجم أي هدف. قوة بروتوكول يمكن مواصلة تطوير تجريبيا من قبلعدة طرق. أولا، واختيار نفسها قد تكون محتملة تحسنت من خلال التحقيق أساليب التحسين مثل تحديد T المثالي م [كدنا] التهجين / المكتبة التي توفر التفاعل الذي هو ضعيف بما يكفي للتفاعل مع هدف جزيء صغير، ولكن قوية بما فيه الكفاية لتقليل كمية من خلفية متواليات dehybridized فقط من الديناميكا الحرارية. هذا وسوف تتكثف عدد الدورات اللازمة لاختيار، وتوفير الوقت في العمل والحد من استهلاك كاشف. أن تحقيقات أخرى إلى تعديلات على اختيار أن يكون لتحديد تركيزات الأكثر ملاءمة من الخرز وDNA بحيث يتم كشفها مجموعة متنوعة من السكان من متواليات لهذا الهدف، خصوصا في الجولة الأولي. نجاح هذه التجارب إثبات صحة المبدأ يوفر أساسا للاستثمار المزيد من الموارد من أجل تحسين وتكييف عازلة فحص AuNP إلى السوائل الفسيولوجية. هناك حاجة مشروعة ل، منصة biosensing قوية السريعة التي يمكن فوnction كأداة تشخيصية من الحالة الفسيولوجية للفرد، ومزيد من التطوير للمقايسة AuNP في مصل الدم البشري، والعرق، أو اللعاب سيجتمعون لهذه الفجوة الحالية.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was performed while the author (JAM) held a National Research Council Research Associateship Award at Air Force Research Laboratories. Co-author MW held a Wright Scholar Fellowship supported by the Air Force Office of Scientific Research. This work was supported by Air Force Office of Scientific Research, Air Force Research Laboratory, and Bio-X Strategic Technology Thrust.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dynabeads M280 Streptavidin | Invitrogen | 112.06D | Compatible with DynaMag-2 Magnet |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | Compatible with Dynabeads M280 Streptavidin |
| Streptavidin Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-5113-01 | This is a high density streptavidin product for ssDNA preparation |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | ≥98% |
| Progesterone | Sigma | P0130 | ≥99% |
| Cholic Acid | Sigma | C1129 | ≥98% |
| NanoDrop ND-1000 | NanoDrop | ND-1000 | Replaced by ND-2000 model |
| Tris Base | Promega | H5135 | ≥99.9% |
| Sodium Chloride | Sigma | S9888 | ≥99.5% |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fluka | 63068 | ≥98% |
| 500 mL Filter System | Corning | 430769 | 0.22 µm cellulose acetate membrane |
| DNA Library | Operon | Custom | HPLC purified |
| All other DNA | IDT | Custom | Capture probes and primers- desalted; Aptamers- HPLC |
| Thermomixer | Eppendorf | R | Any model with temperature and mixing speed control will work |
| PfuUltra II Fusion HotStart DNA Polymerase, 400 rxn | Agilent | 600674 | Taq polymerase can be used as well |
| Deoxynucleotide Mix, PCR-Grade | Agilent | 200415 | Other brands will work here |
| 10x Cloned Pfu DNA Polymerase Buffer | Agilent | 200532 | This buffer was optimized for PfuUltra II polymerase |
| GeneAmp PCR System | Applied Biosystems | 9700 | Any model that allows researcher to open lid for cycle optimization will work |
| Agarose-LE | Ambion | AM9040 | ≥99.9% |
| Ethidium Bromide | Sigma | E-1510 | Acute toxicity, inhalation; suspected carcinogen |
| Empty Synthesis Columns, 1 µm Expedite Style | Glen Research | 20-0021-01 | This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with syringe |
| Replacement Filters Expedite | Glen Research | 20-0021-0F | 1 µm size |
| Illustra NAP-25 Columns | GE Healthcare | 17-0852-01 | Any brand with DNA grade resin gel filtration column will work |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette | ThermoFisher Scientific | 66205 | 2k MWCO used |
| Gold(III) chloride hydrate | Sigma | 254169 | 99.999% purity is important |
| Sodium Citrate Dihydrate | SAFC | W302600 | We have found that the compound produced from different manufacturers greatly affects AuNP assays |
| SpectraMax | Molecular Devices | M5 | Results were similar to Bio-TEK system |
| Synergy | Bio-TEK | HT | Results were similar to Molecular Devices system |
| HEPES Buffer | Amresco | J848 | Any brand that makes a sterilized product will work |
| 250 mL Filter System | Corning | 430767 | 0.22 µm cellulose acetate membrane |
| UV Spectrophophotometer | Varian | Cary 300 | Other brands will work here |
| 5 mL Syringe | Becton-Dickinson | 309646 | This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with Expedite column |
| ThermoEC Minicell Primo | ThermoFisher Scientific | EC320 | Compatible with Power Supply |
| Power Supply | Fisher Scientific | FB300 | Compatible with ThermoEC Minicell Primo |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | Flammable liquid |
| 2 Methoxynaphthalene | Sigma | 148245 | 99% |
| Assay Plate | Corning | 3370 | 96-well Flat Bottom, Sterile |
Referenzen
- McKeague, M., DeRosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. J. Nucleic Acids. 2012, 1-20 (2012).
- Gatti, R., Antonelli, G., Prearo, M., Spinella, P., Cappellin, E., De Palo, E. F. Cortisol assays and diagnostic laboratory procedures in human biological fluids. Clin. Biochem. 42, 1205-1217 (2009).
- Morgan, C. A., Wang, S., Rasmusson, A., Hazlett, G., Anderson, G., Charney, D. S. Relationship among plasma cortisol, catecholamines, neuropeptide Y, and human performance during exposure to uncontrollable stress. Psychosom. Med. 63 (3), 412-422 (2001).
- Michael, D. J., Valle, B., Cox, J., Lalns, J. E., Fogt, D. L. Salivary Biomarkers of Physical Fatigue as Markers of Sleep Deprivation. J. Clin. Sleep Med. 9 (12), 1325-1331 (2013).
- Kwak, J., et al. Volatile biomarkers from human melanoma cells. J. Chrom. B. 931, 90-96 (2013).
- Stevens, R. C., Soelberg, S. D., Near, S., Furlong, C. E. Detection of Cortisol in Saliva with a Flow-Filtered, Portable Surface Plasmon Resonance Biosensor System. Anal. Chem. 80 (17), 6747-6751 (2008).
- Arya, S. K., Ghornokur, G., Venugopal, M., Bhansali, S. Antibody functionalized interdigitated μ-electrode (IDμE) based impedimetric cortisol biosensor. Analyst. 135 (8), 1941-1946 (2010).
- Kapczinski, F., et al. Allostatic load in bipolar disorder: Implications for pathophysiology and treatment. Neurosci. Biobehav. Rev. 32 (4), 675-692 (2008).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Ciesiolka, J., Gorski, J., Yarus, M. Selection of an RNA domain that binds Zn2. RNA. 1 (5), 538-550 (1995).
- Liu, J., et al. Selection of Aptamers Specific for Adipose Tissue. PlosOne. 7, e37789 (2012).
- McCauley, T. G., Hamaguchi, N., Stanton, M. Aptamer-based biosensor arrays for detection and quantification of biological macromolecules. Anal. Biochem. 319 (2), 244-250 (2003).
- Huang, L., et al. A label-free electrochemical biosensor based on a DNA aptamer against codeine. Anal. Chim. Acta. 787, 203-210 (2013).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX—A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomol. Eng. 24 (4), 381-403 (2007).
- Jayasena, S. D. Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival Antibodies in Diagnostics. Clin Chem. 45 (9), 1628-1650 (1999).
- Morse, D. P. Direct selection of RNA beacon aptamers. Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 94-101 (2007).
- Nutiu, R., Li, Y. Structure-Switching Signaling Aptamers. J. Am. Chem. Soc. 125 (16), 4771-4778 (2003).
- Luo, F., Zheng, L., Chen, S., Cai, Q., Lin, Z., Qiu, B., Chen, G. An aptamer-based fluorescence biosensor for multiplex detection using unmodified gold nanoparticles Chem. Commun. 48 (51), 6387-6389 (2012).
- Li, H., Rothberg, L. J. Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction. J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).
- Chávez, J. L., MacCuspie, R. I., Stone, M. O., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer–gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response. J. Nanopart. Res. 14 (9), 1166-1177 (2012).
- Hagen, J. A., et al. Biofunctionalized Zinc Oxide Field Effect Transistors for Selective Sensing of Riboflavin with Current Modulation. Sensors. 11 (7), 6645-6655 (2011).
- Han, K., Liang, Z., Zhou, N. Design Strategies for Aptamer-Based Biosensors. Sensors. 10 (5), 4541-4557 (2010).
- Martin, J. A., Chávez, J. L., Chushak, Y., Chapleau, R. R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol. Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).
- Hall, B., et al. Synthesis, and Amplification of DNA Pools for In Vitro Selection. Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 39, 9.2.1-9.2.28 (2009).
- Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nat. Protoc. 5 (6), 1169-1185 (2010).
- Djordjevic, M. SELEX experiments: New prospects, applications and data analysis in inferring regulatory pathways. Biomol. Eng. 24 (2), 179-189 (2007).
- Thomas, J. R., Hergenrother, P. J. Targeting RNA with Small Molecules. Chem. Rev. 108 (4), 1171-1224 (2008).
- Jing, M., Boswer, M. T. A Review of Methods for Measuring Aptamer-Protein Equilibria. Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-12 (2011).
- Sachs, E. -. F., Diederichsen, U. . Binding of Triostin Analogues to DNA. , (2011).
- Liu, J., Lu, Y. Preparation of aptamer-linked gold nanoparticle purple aggregates for colorimetric sensing of analytes. Nat. Protoc. 1 (1), 246-252 (2006).
- Cho, M., et al. Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (35), 15373-15378 (2010).
- Martin, J. A., et al. Selection of an Aptamer Antidote to the Anticoagulant Drug Bivalirudin. Plos One. 8 (3), e57341 (2013).
- Schütze, T., et al. Probing the SELEX Process with Next-Generation Sequencing. Plos One. 6 (12), e29604 (2011).
- Kupakuwana, G. V., Crill, J. E., McPike, M. P., Borer, P. N. Acyclic identification of aptamers for human alpha-thrombin using over-represented libraries and deep sequencing. Plos One. 6 (5), (2011).
- Smith, J. E., Griffin, D. K., Leny, J. K., Hagen, J. A., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field. Talanta. 121, 247-255 (2014).
- Chatterton Jr, R. T., Vogelsong, K. M., Lu, Y. -. C., Hudgens, G. A. Hormonal Responses to Psychological Stress in Men Preparing for Skydiving. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82 (8), 2503-2509 (1997).
- Gold, L., et al. Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery. Plos One. 5 (12), (2010).
- Musheev, M. U., Krylov, S. N. Selection of aptamers by systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Addressing the polymerase chain reaction issue. Anal. Chim. Acta. 564 (1), 91-96 (2006).
- Wiebe, J. P. Progesterone metabolites in breast cancer. Endocr.-Relat. Cancer. 13 (3), 717-738 (2006).
