修改后的孔板 - 测量行为，认知和社会互动小鼠和大鼠
Summary
This protocol describes the modified hole board, which is a behavioral test set-up that comprises the characteristics of an open field and a traditional hole board. This set-up enables the differential analysis of unconditioned behavior of small laboratory mammals as well as the analysis of cognitive abilities.
Abstract
这个协议描述了改性孔板（MHB），它结合特征从传统孔板和旷场并且被设计来测量无条件行为在小型实验室哺乳动物（ 例如，小鼠，大鼠，树鼩和小灵长类）的多个方面。这种模式是一种使用一个行为测试电池的一个有价值的替代，因为动物的行为简档的宽光谱行为可以在一个单一的测试进行调查。
该装置由一个盒子，代表着“保护”区域中，从一组室分离。甲板，在其上小圆柱体交错排列在三条线，被放置在盒的中心，代表的设置了“无保护的”区域。动物的认知能力可以通过引诱一些钢瓶在董事会和测量工作，并参考内存进行测量。其他无条件的行为，如activitY型所关乎，焦虑所关乎社会的行为，可以用这种模式来观察。行为的灵活性和使其习惯一种新颖的环境的能力，可以另外通过使动物在MHB多次试验，揭示洞察动物的适应能力进行观察。
由于在一个行为测试电池测试阶效应，幼稚的动物应该用于每个单独的实验。通过在一个单一的范例测试多个行为层面并由此避开这个问题，所使用的实验动物的数量减少。此外，通过避免在测试过程中，没有必要食物社会隔离剥夺的动物中，MHB表示一个行为测试系统，诱导如有应力的量非常低。
Introduction
改性孔板（MHB）被用来评估的无条件行为多个维度，主要是在小鼠和大鼠1。一些广泛使用的测试测量单个行为参数，它不完全覆盖一个行为尺寸的整个表型。该MHB是基于鼠类可以展示自己丰富的行为库只有在丰富的测试环境2，从而使复杂的行为学观察的概念开发的。
该组式包括传统孔板和旷场试验的特性，从 而导致一个复杂的单个范例，它克服一个试验电池的缺点（ 即在减少动物的数量用1,3,4，绕过测试顺序5，减少时效和成本6）可能产生的影响。与大多数行为测试（ 例如，Hånell＆Marklund，2014年）7 </ SUP>时，MHB的一个优点是，动物不需要是食物剥夺以增加的动力来解决的任务。此外，社会隔离，可以在测试过程中通过放置在一个（胺基）隔室由透明多孔隔板从测试室中分离的实验动物的组配合，允许视觉，听觉和嗅觉接触8,9-规避。
该MHB已（药理学）验证对小鼠和大鼠1,6。大范围的行为可以测量，如回避行为，风险评估，觉醒，探索，自主活动，习惯，社会亲和力和认知2,8-10。此外，该MHB可以与食物摄取抑制试验，以及新物体识别测试10,11相结合。最后，该MHB也可以使用通过测试社会败动物，同时将一个主导个体中进行社会应力实验组车厢12,13。这个协议对小鼠和大鼠将给MHB的多个应用程序的概述。
Protocol
注：实验已获得大学医学中心的乌得勒支和乌得勒支大学，荷兰的动物实验委员会。此外，动物实验遵循了实验动物保健的原则并参考准则护理和使用哺乳动物神经科学与行为研究。25 1.实验装置注意：标准MHB装置包括从辅助室（50×50×50厘米），其中，实验动物的组中配合可在测试期间被置于分离的灰色PVC实验箱（100×50×50厘米）的由一个透明的，穿孔的分区1。如果组配合的存在是不希望的，或者如果单独圈养动物进行试验，取代通过由灰色PVC的一个分区的透明的分隔（ 图1;又见奥尔等人，（2001）1）。该MHB（WI个不同的测量）用于认知测试中的协议的部分5进行说明。 放置板（60×20×0.5厘米;采用灰PVC）的包装盒中的中间。 注：该板可包含20气缸（ᴓ1.5厘米）14交错排列的两行或23缸（ᴓ3厘米）8交错在三线。 由黑线周围分隔板上的区域为10个长方形（20×15厘米）和2格（20×20厘米）。 定位板之上的舞台灯以创建板之间的光强度较大的对比度（较无保护的区域以开放场或光 – 暗过渡测试的光隔室的中心可比）和盒（保护区）为了增加电路板4,8的厌恶性质。 房子在一个12小时的动物颠倒昼夜周期（ 如灯灭在上午7:00和灯在7:00 PM）。 注：然而，MHB也可以在传统的光时间表（见的潜在缺点讨论）1,6。 在动物中最活跃的阶段进行行为测试（ 例如，上午10时和下午2时00分之间）4,15。 保持2周的动物中的设施到达后一个习惯期。在此期间，有相同的人进行一周的行为实验处理动物4次，包括在实际的测试将被执行的所有处理程序。白天的时间只处理的动物时，动物将在后面暴露于测试。 记录实验数据存储的视频和以优化的结果，并以降低跨观察员变异，练习使用以前的实验2的视频记录的行为打分。确保观察员执行的所有操作和程序规范。 2. BEHAvioral测试 – 不配合集团的存在在房间里的动物经常容纳在执行行为测试（以避免运输到测试位置的可能的影响）和动物中的设施（使其习惯动物对设备的存在）到来之前安装所有的测试设备。 拿起动物的尾巴的基地从家笼，并直接将其放置在MHB。 将每个动物在面壁（ 如图1所示）相同的转角的装置。 允许动物自由探索MHB一段时间（通常是5分钟1,6,16-18）。 拥有一支经验丰富的观察者现场比分使用行为记分软件的行为参数。使用表1中列出的参数。 注：某些行为参数（ 如电机和探索行为）可能会自动为如得分， </em>（2010年）19后MHB必要的调整，亨利等人讨论。 为了避免基于嗅觉暗示偏压每次试验后清理用自来水和纸巾的装置。 注：测试社会安置动物时可能测试阶作用，应牢记17,20。 3.行为测试 – 在小组配合的存在在组壳体的情况下，测量与实验动物和测试期间其保持架配合的相互作用。 放置组配合在该组隔室的实验动物试验之前，以允许习惯（主要是10-30分钟1,12）。 注：社会应激条件下的测试，可以通过测试一个社会个体击败13时，将主导笼队友在小组车厢。 将实验动物在测试隔室，并允许它以释放LY探索MHB在第2节。 注：测试社会安置动物时可能测试阶作用，应牢记17,20。 拥有一支经验丰富的观察者现场比分使用行为记分软件的行为参数。使用表1中列出的参数。 为了避免基于嗅觉暗示偏压每次试验后清理用自来水和纸巾的装置。 4.新物体识别和食物摄入量抑制熟悉的动物对象（例如一个骰子或食品粒料）在他们的家笼，实验前2天。 从在从起点的角跨越一个新的物体（例如螺栓或不熟悉的食品）将熟悉物体在装置相距2厘米。 测量动物需要接近小说和熟悉对象/食物的时间。使用的参数中<STRONG>表1。 为了避免基于嗅觉暗示偏压每次试验后清理用自来水和纸巾的装置。 5.认知测试用于测试的大鼠3,22放置一个较小的电路板（35×22×1厘米）10缸中的框的中部（ 图1）。减少大小为50×50厘米框插入制成的灰色PVC的分区检测小鼠21。 气味所有气缸有味道的动物被吸引到（ 例如香草）和奖励（ 例如，一块杏仁，一个非常可口奖励小鼠和大鼠）网格下饵都让动物无法将其删除。 提示缸（通常3）用五色环（带有灰色PVC对比），并引诱他们一个可拆卸的奖励（ 如 0.05克一块杏仁）。 在实验前，熟悉日常在2天的奖励动物他们的家笼用的镊子提供，并确保动物吃。 拥有一支经验丰富的观察者现场比分使用行为记分软件的行为参数。测量与所述例外识别物体或食物摄取抑制相关的参数，除了在第2（ 表1）中提到的行为参数在表2中列出的参数。 阶段1：对于每个动物，每天进行四个试验具有恒定 审间间隔（ 例如，30-60分钟），直到一个恒定的时间来完成试验达到（ 即，当所有三个杏仁片已经被收集）。 第2阶段：提示和鱼饵三种不同的汽缸，然后将动物在设置四个试验，以测试逆转学习能力。 为了避免基于嗅觉暗示偏压每次试验后清理用自来水和纸巾的装置。
Representative Results
大量的参数，可以在MHB来测量使该设置特别适用于测量众多行为层面。其中一个例子是行为适应的鉴定到一种新的环境通过重复暴露于测试。 。Salomons等 （2010）研究了小鼠（BALB / CJ和129P3 / J）的MHB两个近交系的习惯在两个不同的光照条件下（红灯：45勒克斯与白光：框和板之间的对比：框和板之间的对比：115勒克斯（另见协议第1.3节））4。 BALC / cJ小鼠显示减少（habituating）延迟，直到第一板条目（见表1）在红光条件下， 如图2A所示 。与此相反，129P3 / J小鼠表现出习惯的迹象了试验。 图2B显示在白色光线条件下的实验。 BALB / cJ小鼠再显示一个减小延迟到第一板条目以上试验尽管该一nimals显示较慢的习惯模式相比，红光条件。 129P3 / J小鼠不仅显示再次受损习惯，也是白色光的条件下向致敏的趋势。同样地，在一项研究Salomons（2012）129P2 / OlaHsd小鼠显示受损的行为灵活性响应于新颖相比只BALB / cOlaHsd小鼠23。在习惯能力的不同，当在MHB 4测试也因此成为小鼠两个近交系之间的明显。 认知版本的MHB的可以例如被用于测量认知损伤的小鼠。范德Kooij 等 。 （2010年）中使用这种设置来测量C57BL / 6J小鼠轻度脑缺氧缺血的认知功能（缺氧45分钟; HI-45），严重的HI（75分钟缺氧; HI-75）和sham-对照组小鼠9。完成试验的能力（ 即，发现在5分钟内的饵孔）示于图3A。 </stroNG>的短期记忆失误数（重温了饵孔），长期记忆错误（访问非饵孔）和遗漏错误（没有访问被逼急的孔）， 如图3B-D分别。 为了证实对HI-45组无认知损伤，这组抗假控制在反转任务测试。三饵孔被任命为三个不同的汽缸和动物测试4项试验。第一阶段的最后试验用的反转级的第一试验比较时的逆转作用变得很明显。完成4逆转试验的持续时间给出的指示对整体性能。 图4示出的等待时间，完成试验为两组，并明确整体治疗效果是明显的。这意味着，在逆转的任务的确有认知灵活性（重新学习）在HI-45组的这是一个障碍使用MHB 9来检测。 图修改后的孔板1示意图。 （一）设置了由一个测试盒（箱）与在（无保护）董事会表示有锯齿线和组车厢中间。 =新物体， =熟悉的对象， =起点。（B）的认知版本改性孔板的小鼠的示意图概述。气缸（C）的侧视图中认知版本改性孔板的使用。一块杏仁放在所有气缸的网格下方。目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。 图2.红色光或白色光的条件。 （A）延迟，直到第一次董事会记录（指+ SEM）BALB / CJ，并在红光条件下（0-5盒勒克斯和板45勒克斯）测量123P3 / J小鼠。重复测量ANOVA与Huyn-Feldt调整透露的应变（P = 0.025），试验（P <0.001），试验X应变的相互作用（P <0.001）效果事后分析：菌株之间：* = P <0.0026之间连续两个试验：$ = P <0.0026（BALB / CJ）（B）第一板条目的潜伏期（平均+ SEM）在白光条件（盒0-5勒克斯和电路板120勒克斯）。重复测量ANOVA与Huyn-Feldt调整透露的应变（P = 0.031），试验（P <0.001），试验X应变的相互作用（P <0.001）EFFE。克拉事后分析：* = P <0.0026，连续两次试验之间：$ = P <0.0026（BALB / CJ）和T = P <0.0026（123P3 / J）菌株之间。这个数字已经被修改Salomons 等人 2010年4月。 请点击此处查看该图的放大版本。 在MHB图3.认知测试（阶段1）。所有的数字显示平均+ SEM（A）的潜伏期，完成假对照组小鼠的试验（秒），HI-45和HI-75（B）遗漏错误数，（C）非饵孔互访和（D）重访的诱饵孔。 * = P <0.05，** = P <0.01，*** = P <0.001假与HI-75，＃= P <0.05，## = P <0.01，### = P <0.001HI-45与HI-75。这个数字已经被修改范德Kooij 等人，2010年9。 请点击此处查看该图的放大版本。 图4.逆转学习任务（第2阶段）。延迟完成试验（秒），在逆转学习任务（平均+ SEM）。试用效果：＃= P <0.05，## = P <0.01（一审逆转的任务与以往的审判）。治疗效果：* = P <0.05，** = P <0.01（HI-45与假）。这个数字已经被修改范德Kooij 等人，2010年9。 系统 活动 测得的参数 AVOidance 进入董事会频率，延迟（S），持续时间（％）和平均持续时间（S）在董事会风险评估拉伸出席频率和延迟时间（S）伸展身体姿势（包括后肢） 觉醒宠物美容频率，延迟（多个），持续时间（％）和平均持续时间（S）的自修饰排便频率和薄利的潜伏期（S）生产排尿频率和排尿的潜伏期（S） 导演探索孔探访频率和汽缸访问延迟（S） 新物体的探索频率，延迟（多个），持续时间（％）和平均持续时间（S）探索新物体无方向的探索饲养箱</TD> 频率和后脚站起的潜伏期（S）在框中（前爪不碰墙） 饲养板频率和后脚站起的潜伏期（S）在董事会孔探频率和汽缸探索的潜伏期（S） 记忆熟悉对象的探索频率，延迟（多个），持续时间（％）和平均持续时间（S）探索熟悉的物体社会亲和力小组互动频率，延迟（多个），持续时间（％）和平均持续时间（S）与该组隔室相互作用自主活动线路穿越次数的越线延迟（S） 表1：行为参数一览 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing ="“0”"> 内存系统 参数 描述 长期记忆 错误的选择参观非饵缸;鼻子边缘下方 遗漏错误 一个诱饵缸遗漏没有访问一个诱饵缸 短期记忆 重复的选择重温到开涮缸;鼻子边缘下方 整体表现 总的试用时间时间，直到所有开涮缸已被访问 表2：认知参数一览
Discussion
该MHB范例可以用于测量无条件行为多个维度。该协议可以根据实验的目的略有改变。在这个协议中，我们讨论的设置，时间和测量通常是在我们的实验室中使用。然而，轻微的偏差，以该装置的测量已被用于在过去和也在板气缸的量可以变化3。经常研究使用，每试验5分钟的测试时间，但其他的测试时间也可以是适当的， 即，一旦结束测试的认知试验已成功，或延长测试时间完成，如果动物是非常急或身体受损。测试一天的时间被选定为红光下条件，因为老鼠是夜行性动物，是最活跃的早期黑暗阶段。 Roedel 等人（2006）示出了光或黑暗阶段测试对行为和认知性能的影响在DBA小鼠的MHB 16。其他的研究已经进行在白光条件1,6- MHB实验，然而，应当注意的是，在白光下的条件测试可诱导行为抑制和认知中断（如图DBA小鼠）16。
表1和2含有待测量的大量的行为参数。在数据分析期间，这可能导致一些参数，指示例如“延迟到第一引入板'的显著增加，但不是在同一激励系统的其它参数（在这种情况下，”避免'）。在某些情况下，这可能会导致不确定的结果。 GUILLOUX 等人（2011）介绍了集成行为z得分的行为表型在小鼠24上 。与使用综合行为z得分的多个参数可被组合到单个z得分描述特定motivatio最终系统。随后的z分数可以在轮到自己更轻松地在行为测试和实验对比。
除了 这种模式的描述的特征，更深刻的使用成为Salomons 等人的研究清楚。（2012）。习惯化的两个小鼠品系（BALC / CJ和129P3 / J），在MHB新颖性进行了比较，显示出在行为灵活性差表示129P3 / J小鼠4的非自适应行为简档，镜像受损适应能力和可能甚至病态的焦虑。
最后，该MHB允许多个行为层面在一次实验中测量。通过从传统孔板和开放现场测试，无条件的行为，社会交往，认知和适应能力， 即结合的特点，福利可以进行调查。该测试可以例如用于评估由于行为变化到pharmacological-和/或遗传操作，选育和适应能力。相较于传统的测试电池，所需要的动物的数量明显减少，应力测试期间所经历的动物是非常低的。
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the work of Annemarie Baars and José Lozeman-van ‘t Klooster in performing, assisting and teaching experiments using the mHB set-up.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Standard mHB apparatus | N/A | N/A | The standard mHB apparatus consists of a grey PVC experimental box (100x50x50 cm) separated from a group compartment (50x50x50 cm) by a transparent, perforated partition. If the presence of group mates is unwanted or if individually housed animals are tested, the transparent partition is replaced by a partition made of grey PVC. The board (60x20x0.5 cm; made of grey PVC) is placed in the middle of the box and can contain 20 cylinders (ᴓ 1.5 cm) staggered in two lines or 23 cylinders (ᴓ 3 cm) staggered in three lines positioned on the board. The area around the board is divided by black lines into 10 rectangles (20×15 cm) and 2 squares (20×20 cm). |
| Cognitive mHB apparatus | N/A | N/A | The box for cognitive testing is 50×50 cm by inserting a partition made of grey PVC in the standard mHB. A smaller board (35x22x1 cm) with 10 cylinders is placed in the middle of the box. All cylinders are scented with a flavor animals are attracted to (e.g. vanilla) and all are baited with a reward (e.g. a piece of almond) beneath a grid so the animals cannot remove it. Cylinders (often three) are cued with a colored ring (contrasting with the grey PVC) and are baited with a removable reward (e.g. 0.05 g piece of almond). |
| Vanilla flavor | N/A | N/A | Vanilla flavor dissolved in water (0.02%) |
| Camera | N/A | N/A | Camera that generates sufficient quality output to rescore the behavior from video. |
| Stage light | N/A | N/A | A theather light that allows to adjust the light intensity and the dimensions of the surface that is lit. |
| Behavioral scoring software | N/A | N/A | Behavioral scoring software. |
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Labots, M., Van Lith, H. A., Ohl, F., Arndt, S. S. The Modified Hole Board – Measuring Behavior, Cognition and Social Interaction in Mice and Rats. J. Vis. Exp. (98), e52529, doi:10.3791/52529 (2015).