Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.
The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.
Прошло уже более полувека с момента первого доклада естественным изменения ДНК в виде цитозина метилирования 1. Цитозин метилирование представляет собой модифицированный нуклеотид цитозин базовой где 5-й углерода от основного кольца имеет метильную группу (5-MC), наиболее часто встречающихся в динуклеотид CpG мотивов в геномах млекопитающих. Функциональный наличие 5-MC в промоторов генов, как правило, связаны с транскрипционной репрессии, а отсутствие связано с транскрипционной активности 2.
Огромные успехи были достигнуты в нашем понимании роли метилирования ДНК в развитии 3, распространения transgeneration эпигенетических профилей 4, патогенез рака 5,6, и ряд других научно-исследовательских областях. Многие из этих достижений стали в последние несколько лет, как новые методы были разработаны в профиль метилирования ДНК 7. С появлением ипопуляризация последовательности (NGS) методов нового поколения в настоящее время ряд методов профиль метилирования ДНК в пределах всего генома или крупных регионов генома 8. Эти подходы открывают возможность изучения обнаружения, количественной ДНК метилирования и различия в метилирования ДНК. В дополнение к этим гипотеза, приносящей подходов, есть значительная потребность в целевых / проверки гипотез ДНК методами метилирования количественного определения.
Пиросеквенирование, метилирование специфичная ПЦР и прямого Sanger секвенирования бисульфит преобразованного ДНК были наиболее используемых методов для анализа целевых регионах (например, область промотора одного гена или остров CpG) 9-12. Все эти методы основаны на бисульфита преобразования, в результате химической реакции дезаминирования, где неметилированные цитозина конвертируются в урацил, тогда как метилированных цитозина годов остаются неизменными 13,14. ПЦР-амплификация bisulfite-преобразованные результаты ДНК в замене урацила с тимин 15, позволяющие дифференциального метилирования считывать как разница базу. В то время как весьма полезным, ограничения этих методов относятся низкий количественный точность, короткую длину читать, и низкую пропускную образца. Для устранения этих недостатков был разработан метод мы назвали бисульфит Amplicon Секвенирование (BSAS) 16. Цель этого метода состоит в том, чтобы иметь возможность анализировать целевые геномные районы, представляющие интерес в большом количестве образцов с высокой количественной точностью.
BSAS использует элементы существующих методов (бисульфит преобразования и конкретного региона ПЦР-амплификации) и объединяет их с простой конструкцией следующего поколения библиотеку (transposome-опосредованной) 17 и настольный NGS 18 (рисунок 1). Такой подход обеспечивает более количественного и выше способа пропускной изучения цитозин метилирование в любой интересующей области. Здесь мы представляемМетод подробно и описать подходы для поиска неисправностей и проверки качества процесса BsAs.
BSAS позволяет целенаправленной, точной метилирования ДНК количественного с высокими возможностями пропускной способности в оба Количество образцов и количество целей. Кроме того, эта библиотека поколения с использованием transposome-опосредованной tagmentation требует меньше ввода ДНК, быстрее и содержит меньше шагов, чем традиционные стрижки и последующих методов лигирования адаптеров. Эти усовершенствования по сравнению с существующими методами позволяет точно базового уровня метилирования ДНК анализа любой цели, представляющей интерес. Кроме того, BSAS обеспечивает новый метод для подтверждения регионах, представляющих интерес (дифференциально регионы метилирования (DMRs), CpG островков, регуляторных областей), которые были определены с помощью целого генома бисульфит 22 или захватить 23 подходов. Использование ортогональных подходы подтверждения и более количественно точные методы улучшает аналитическую строгость эпигеномном исследований. Высокая глубина чтения достигается с BSAS позволяет точно оценить в узком доверительном интервале, повторноконсалтинговой в точную количественную оценку 16. Кроме того, способность запускать многие образцы в одном эксперименте можно увеличить размер выборки для подтверждения целых методов генома, что позволит увеличить статистическую мощность; Слабость многих современных эпигенетических исследований. Важно отметить, что BSAS обеспечивает базовый конкретных CpG метилирования подсчета, которая позволяет для генерации проверяемых гипотез для эпигенетической исследований. Гипотезы, такие как увеличение метилирования в определенном элементе реакции приведет к снижению связывания конкретного фактора транскрипции. BSAS, в сочетании с парных данных экспрессии мРНК, относится к способу получения как эпигенетической регуляции и экспрессии мРНК в течение одного куска ткани или клеточной популяции. Парные измерения регулирования и выражения также увеличить научную строгость и влияние результатов.
Основные этапы в протоколе СДБМ включают праймеров, оптимизация ампликона и библиотеки поколение /QC. Смещения ПЦР вводится, если грунты не предназначены правильно и усиливаются при различной эффективностью 8. Использование метилирования стандартов, таких как ферментативно генерируемых 100% и 0% цитозина метилированных стандартов, могут быть использованы для определения степени, если таковые имеются, метилирование количественного смещения, и собственно методологический контроль при количественной метилирование 16. Кроме того, следует соблюдать осторожность при оптимизации ПЦР-реакции для генерирования одного высококачественного ампликона. Если не ампликон не присутствует с использованием предложенных руководящими принципами, изложенными в протоколе, меры по оптимизации включают в себя все большее число ПЦР циклов или количество входной bsDNA. Если имеется несколько ПЦР-продукты, в том числе праймеров димеров, шаги оптимизации включают в себя уменьшение количества входной bsDNA, уменьшение молярные концентрации входных ПЦР-праймер, повышение температуры отжига или уменьшении числа PCR цикл. Один или сочетание этих процедур оптимизации дает достаточные результаты для генерации одного HIGH-качество ампликон. Кроме того, реорганизации праймеров хорошо подходят для наборов праймеров, которые не дают ни одного ампликон. Для тех регионах, где реконструкция не подходит или это возможно, вырождаются наборы праймеров в том числе оба могут работать цитозин-х и тимин по адресу CpG-сайтов в прямых праймеров и аденин-х и гуанин-х в CpG-сайтов в обратных праймеров. Тем не менее, эти наборы праймеров нуждаются в дальнейшей оптимизации, чтобы убедиться в отсутствии ПЦР смещения происходит, процесс вне рамок этого протокола. Библиотеки Качество очень важно для достижения успеха. Убедитесь, что меры контроля качества осуществляется для определения размера, качества и количества библиотек, прежде чем секвенирования. Реакции секвенирования может привести к неудачам с вводом низкого качества библиотек. Смещение в метилирования количественного могут быть смягчены за счет обеспечения, что частоты метилирования присутствуют в прямом и обратном последовательности читает. Кроме того, качество оценки оснований, совместив на сайты CpG должны быть ≥Q30 за большой сотрудничестваnfidence в количественного определения. В то время как другие, ранее практически не показано, не предвзятость в tagmentation реакций бисульфита преобразованного ДНК 19, обеспечивая показатели, описанные выше, позволяет для подтверждения низкого метилирования смещения количественного определения.
BSAS настоящее измеряет метилирование CpG на участках, однако, будущие расширения этого метода позволит паре измерений CpG 5-HMC с добавлением экспериментальных этапов, отличающих между 5-MC и 5-HMC, таких как введение перрутенат калия до бисульфита преобразования 24. Это приведет к увеличению влияния СДБМ полезности, позволяя для парного метилирования, как 5-MC и 5-HMC, и данные экспрессии с целью определения экспрессии генов регуляторную роль метилирования ДНК. Transposome-опосредованной препарат библиотека ПЦР ампликонов действительно приводит к уменьшению глубины секвенирования на концах амплифицированных областей. Таким образом, регионы большой интерес должен быть разработан проживать в середине ампликонов. Каклибо, потому что BSAS генерирует последовательность чтения глубины> 1000 X, количественного точности 5-MC измерений вблизи концов амплифицированных областей остается высокой.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Colleen Van Kirk for mouse retina and cerebellum samples, and Peter Gregory for figure generation. The authors also thank Dr. Allison Gillaspy and the Laboratory for Molecular Biology and Cytometry Research core for access to the MiSeq. This work was supported by NIH grants DA029405, EY021716, and AG026607 and the Donald W. Reynolds Foundation.
Name | Company | Cat # | Comments |
Agilent 2100 Bioanlyzer | Agilent | G29393AA | |
Agilent RNA 6000 Nano kit | Agilent | 5067-1511 | |
Agilent High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Typhoon 9200 | Amersham/GE Healthcare Life Sciences | ||
Agencourt AMPure XP – PCR Purification | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
PowerPac Basic Power Supply | Bio Rad | 164-5050 | |
twin.tech PCR plate 96 | Eppendorf | 951020362 | semi-skirted |
Heatsealing Film | Eppendorf | 0030127838 | |
Heatsealing Foil | Eppendorf | 0030127854 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390000.024 | |
0.1-10ul Tips | Eppendorf | 0030073.002 | |
2-200ul Tips | Eppendorf | 0030073.045 | |
50-1000ul Tips | Eppendorf | 0030073.100 | |
MixMate | Eppendorf | 5353000.014 | |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 0030121.023 | |
Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424000.010 | |
2.0 mL Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 022363352 | |
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | 24 rxn |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | 24 indexes |
MiSeq Desktop Sequencer | Illumina | ||
MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2002 | 300cycle |
KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4824 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | |
Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit | Life Technologies | R11490 | |
ProFlex 96-well PCR system | Life Technologies | 4484075 | |
Novex 6% TBE DNA gel | Life Technologies | EC6261BOX | 10-well |
Novex TBE Running Buffer | Life Technologies | LC6675 | 5X (1 L) |
Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Life Technologies | LC6678 | 5X (10 mL) |
1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787-018 | |
Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | |
UltraPure 10mg/mL Ethidium Bromide | Life Technologies | 15585-011 | |
7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 | 384well block |
DynaMag-96 Side Skirted | Life Technologies | 12027 | |
SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices/VWR | 89429-532 | |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
Stainless Steel Beads | Qiagen | 69989 | 5 mm |
CLC Genomics Workbench | Qiagen | Software for methylation pipeline | |
QIAQuick PCR Purification kit | Qiagen | 28104 | 50 rxn |
TissueLyser II | Retsch/Qiagen | 85300 | |
Nuclease-Free Water | Sigma | W4502 | |
TRIS hydrochloride | Sigma | PHG0002-100G | |
Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
384-well Full-Skirted Plate, Standard | Thermo Scientific | AB-1384 | |
Absolute qPCR Seal | Thermo Scientific | AB-1170 | |
EZ DNA Methylation-Lightning kit | Zymo Research | D5030 | 50 rxn |
ZymoTaq DNA Polymerase | Zymo Research | E2001 | 50 rxn |