1. Isolement de l'acide nucléique à partir du tissu REMARQUE: Co-isolement de l'ADN et de l'ARN à partir du même échantillon de tissu offre la possibilité de recueillir l'ADN pour une analyse épigénétique et ARN appariées pour l'analyse de l'expression génique. L'exemple donné ici est une forme de la colonne de purification du tissu expérimental, mais des approches alternatives pour différents types d'échantillons ou d'autres méthodes d'isolement peut être utilisé. L'exigence principale est de l'acide nucléique hautement purifiée sans contaminer protéines ou des solvants organiques. Sélectionnez un morceau de tissu frais congelé ou frais pour l'homogénéisation mécanique et placer sur la glace. Magasin ou un tissu de transfert à un fond rond microtube 2,0 ml. Ajouter une bille de 5 mm en acier inoxydable à chaque tube contenant du tissu. Ajouter une quantité appropriée de tampon de lyse, basé sur les suggestions du fabricant de nombre de cellules ou le poids des tissus. Homogénéiser le tissu en utilisant une homogénéisation mécanique au broyeur à billes30 Hz pendant 30 sec. REMARQUE: La fréquence et la durée de l'homogénéisation mécanique dépend du type de tissu. Tissus tendres seront complètement homogénéiser en utilisant les paramètres recommandés, alors que les tissus plus sévères nécessitent la mise en optimisation. Effectuer l'isolement de l'ADN et de l'ARN en utilisant des colonnes de centrifugation de silice à la température ambiante suivant le protocole du fabricant. Elute ARN dans 50 ul d'eau sans RNase et lieu sur la glace. Utilisation de l'ARN pour l'analyse de l'expression des ARNm par PCR quantitative. Eluer l'ADN dans 100 ul de tampon TE. Répétez élution hors colonne d'ADN en utilisant l'éluant pour augmenter la concentration de l'ADN et le rendement. Utilisation pour la quantification de l'ADN ciblé de la méthylation. Évaluer la qualité de l'ADN et de l'ARN en utilisant un spectrophotomètre standard pour absorbance à 230 nm, 260 nm, 280 nm et 320 nm. NOTE: A260 taux / A280 devrait être ~ 1,8 à 2 pour les ADN de haute qualité. A260 rapport qualité / A280 devrait être ~ 2 pour l'ARN de haute qualité. La présence d'un excès absorbance à 230 nm indicates contaminants de la procédure d'isolement. Vérifier la qualité de l'ARN en utilisant en outre une puce d'électrophorèse capillaire selon les instructions du fabricant. REMARQUE: ARN de haute qualité aura un certain nombre d'intégrité de l'ARN (RIN)> 8. La présence de pics supplémentaires dans l'électrophorégramme en outre des pics d'ARNr indiquer une contamination de l'échantillon. Quantification de l'ADN et de l'ARN par dosage par fluorescence selon le protocole du fabricant. NOTE: L'utilisation d'un dosage fluorométrique est plus sensible et spécifique pour la quantification des acides nucléiques que spectrophotométrie seul. Magasin ADN et de l'ARN isolé à -80 ° C. 2. Identification cible et l'amorce de conception Déterminer la région génomique (s) d'intérêt à analyser par BSAS sur la base de la séquence du génome de référence approprié. Les promoteurs de gènes de gènes exprimés de manière différentielle sont des objectifs communs de méthylation quantification. Préparer un bisulfite in silico-convertgénome de référence pour l'alignement ed tard du séquençage lit en modifiant le fichier de séquence .fasta dans un éditeur de texte. Dans l'orientation 5'-3 ', remplacer les non-CpG avec de la cytosine (la figure 2) de la thymine. Conception des ensembles d'amorces pour amplifier les régions d'intérêt de l'ADN converti au bisulfite. Sélectionnez et copiez la région non converti d'intérêt, dans l'orientation 5'-3 ', dans une PCR programme de conception d'amorce spécifique de bisulfite (Figure 3). REMARQUE: Un optimale au bisulfite PCR longueur d'amplicon est de 250 à 400 pb par amplicon que des fragments d'ADN et traitement au bisulfite, il est difficile pour amplifier grandes> 400 pb régions. Si, par exemple, une région de 1 kb présente un intérêt, de multiples paires d'amorces peuvent être conçues pour couvrir cette région. Conception amplicons d'être de la taille de pb égal pour la mise en commun facile. Évitez longueurs d'amplicon <250 pb, car ceux-ci peuvent être d'une longueur insuffisante pour la génération bibliothèque. Une longueur de l'amorce optimale pour BSAS est>20 points de base par amorce. Choisissez une gamme T m de 55 à 65 ° C et une différence m max de T entre amorces sens et antisens de 1-2 ° C. Sélectionner des paires d'amorces qui couvrent le mieux la région d'intérêt. Ne pas sélectionner des amorces qui contiennent des sites CpG ou directement à côté de sites CpG, car cela provoquerait biais dans les réactions PCR. Utilisez amorces PCR standard qui peuvent être commandés depuis ne importe quel nombre de fournisseurs académiques ou commerciales. Reconstituer amorces lyophilisées dans RNase / DNase eau libre à un stock de travail de 100 um. Magasin amorces PCR à -20 ° C. Diluer 100 uM amorce stocks à 10 um stock de travail pour les réactions PCR. 3. Optimisation PCR spécifique bisulfite NOTE: Pour conversion au bisulfite de l'ADN génomique, un certain nombre de différents kits commerciaux pour conversion au bisulfite sont disponibles. Sélectionnez le kit ou le protocole qui convient le mieux l'expérience prévue. <ol> Utilisation entre 200 ng à 2 pg d'ADN génomique. Pour les expériences d'optimisation, exécuter plusieurs réactions de conversion afin d'avoir suffisamment de bisulfite converti ADN pour plusieurs réactions BS PCR. Utilisation petites (par exemple, 10 ul) des volumes d'élution de l'ADN converti au bisulfite pour maintenir des concentrations élevées d'ADN. REMARQUE: 1-2 pi de l'ADN converti au bisulfite est suffisante pour les réactions PCR d'optimisation si une pg d'ADN génomique a été utilisé pour l'entrée de conversion. Amplifier bisulfite ADN converti par PCR spécifique bisulfite. BS-réactions PCR nécessitent l'aide d'un Taq polymérase capable d'amplifier l'ADN converti au bisulfite. Assemblez la réaction suivante pour l'optimisation cible d'amplification d'un seul amplicon. Pour plusieurs échantillons, assembler des réactions dans une plaque PCR 96 puits. 2x tampon de réaction de 25 ul 0,5 ul de mélange dNTP 5 pi 10 Forward Primer uM (finale 1 uM) 5 ul de 10 uM amorce inverse(Finale 1 uM) 2 ul de matrice d'ADN converti au bisulfite 0,4 pi (5 U / ul) d'ADN polymerase 12,1 eau libre de DNase ul (volume réactionnel final de 50 pi) Sceller plaque PCR avec l'adhésif approprié ou film thermo-scellé. Placez réaction dans un cycleur thermique approprié et utiliser les conditions de cyclage suivantes avec un couvercle chauffée: Effectuer une dénaturation initiale à 95 ° C pendant 10 min. Dénaturer à 95 ° C pendant 30 sec. Recuit pendant 30 secondes à la Tm des amorces spécifiques des cours d'utilisation. Commencer à une température de recuit de quelques ° C au-dessous de la Tm de l'amorce pour des réactions d'optimisation. NOTE: Les meilleurs températures de recuit peuvent également être déterminées en utilisant un cycleur thermique gradient de tester une gamme de températures. Effectuer une extension à 72 ° C pendant 30 secondes. Allonger le temps d'extension pour plus amplicons. Répétez les étapes 3.3.3.2-3.3.3.4 pour 35 cycles àtal pour l'optimisation initiale. Un plus grand nombre de cycles peuvent être nécessaires, mais doivent généralement être évité pour prévenir amplifications clonales qui créeront des artefacts de réaction. Effectuez une extension finale à 72 ° C pendant 7 min. Maintenir réactions à 4 ° C. Visualisez amplicons par électrophorèse PAGE. En variante, en utilisant une puce à ADN d'électrophorèse capillaire selon le protocole du fabricant. Mélanger 24 ul de la réaction PCR avec 6 pi de 5x colorant de charge sur la glace et le vortex. Faire 1 L de TBE 1x tampon de migration en mélangeant 200 ml de 5x TBE courir tampon et 800 ml de ddH 2 O. Diluer échelle d'ADN à une concentration finale de 0,5 ug par puits dans ddH 2 O et de colorant de charge. puits de charge avec 30 pi de réactions PCR ou échelle. Exécutez le gel à 200 V pour ~ 45 min. Arrêter le cycle de gel lorsque le premier front de colorant atteigne l'extrémité du gel. Colorer le gel avec 5 ug / mlbromure d'éthidium en mélangeant 5 ul de 10 mg / ml dans 100 ml de ddH 2 O. Couvrir l'ensemble gel, et laisser incuber pendant ~ 5 min. Image du gel via une boîte de lumière UV ou imageur multimodal à une longueur d'onde d'excitation de 482 nm. En référence à l'échelle, la taille des amplicons PCR et déterminer la spécificité de la réaction par la recherche de plusieurs bandes autres que la taille de l'amplimère attendu (figure 4A et C). Lorsque les conditions optimales pour BS-PCR ne ont été déterminées, effectuez BS-PCR sur des échantillons expérimentaux. Purifier amplicons à partir d'amorces restantes et les autres composants de la réaction. Effectuer silice purification sur colonne, SPRI perle, ou à base de gel de nettoyage et de quantification. Amplicons Éluer de tampon TE 30 pi. Quantifier amplicons utilisant dosage fluorométrique utilisant les protocoles du fabricant. Se il ya plusieurs amplicons par échantillon, en commun eux à poids égal par volumemontants et conserver à -20 ° C. 4. NGS Bibliothèque préparation et Bibliothèque QC REMARQUE: la préparation de la bibliothèque BSAS NGS utilise un protocole de médiation transposome simplifiée avec double indexation (Voir liste des matières pour plus de détails sur la bibliothèque sélection de kit de préparation). Cette méthode fournit une voie extrêmement rapide et à haut débit pour la construction bibliothèque qui a été validée et montre peu ou pas de biais dans les applications de séquençage bisulfite 16,19. Double-indexation permet un multiplexage élevé d'échantillons que seule indexation. Autres styles de préparation bibliothèque peut être possible mais ne ont pas été testés. Préparer bibliothèques END de amplicons BS PCR dans une plaque PCR 96 puits. Diluer amplicons à 0,2 ng / pl pour une masse d'entrée finale de 1 ng, ou 5 ul de la 0,2 ng / ul de dilution. Effectuer un nettoyage des bibliothèques générés en utilisant des billes SPRI. Utilisation de 50 à 90 ul de perles pour isoler SPRI w bibliothèquesvec ce protocole. Le volume de billes SPRI dépend de la taille cible de la bibliothèque et le nombre de cycle de réactions de séquençage souhaités. REMARQUE: Utilisez un agitateur de microplaques ou une plaque vortex pour remettre en suspension des perles. Éluer les bibliothèques et les billes hors de transférer une nouvelle plaque à 96 puits et sceller avec un film de scellement à chaud pour le stockage à -20 ° C. Déterminer la taille et la concentration des bibliothèques (Figure 4B et D). Bibliothèques exécuté sur un ADN d'électrophorèse capillaire puce d'ensimage selon les protocoles du fabricant. Utilisation d'un dosage d'ADN par électrophorèse capillaire à haute sensibilité pour déterminer la taille moyenne des pics détectés de la bibliothèque et une estimation de molarité selon les protocoles du fabricant. Quantifier les bibliothèques par qPCR, utilisant des amorces conçues contre les séquences d'adaptation dans les bibliothèques générés et normes d'utilisation avec une concentration connue. Exécuter qPCR reactions sur un instrument en temps réel en utilisant les paramètres de quantification absolue selon les protocoles du fabricant. Utiliser la taille des bibliothèques et la quantification molaire de qPCR pour calculer les concentrations molaires des bibliothèques. Diluer bibliothèques à 4 nm en utilisant 10 mM de Tris-Cl avec 0,1% de Tween-20 à pH 8,5. bibliothèques de magasins dans un 96 puits plaque PCR scellée avec un film de scellage à chaud à -20 ° C. 5. bibliothèques de séquençage en utilisant un séquenceur de paillasse Dégeler et préparer des réactifs selon les instructions du fabricant. Décongeler quatre bibliothèques nm sur glace. Faire 1 ml de NaOH 0,2 N dans un tube de 1,5 ml. Piscine 4 bibliothèques nM dans des quantités de volume égal, si plusieurs bibliothèques doivent être utilisés. Diluer et de dénaturer bibliothèques regroupées selon les instructions du fabricant à la concentration souhaitée molaire final. Gardez dilué et dénaturerbibliothèque commun sur la glace jusqu'au moment de charger réactif sur la cartouche. Générer une information d'index feuille d'échantillon contenant les noms d'échantillons et correspondant et spécifiez pour générer .fastq fichiers seulement. feuille d'échantillon de charge dans le dossier de la feuille d'échantillon correspondant sur le séquenceur. Ajouter un total de 600 ul dilués et bibliothèque dénaturé à la cartouche de réactif dans le puits correspondant. Exécutez les réactions de séquençage à terminaison. Analyse 6. méthylation quantification de données NOTE: Il ya plusieurs programmes disponibles pour l'analyse des données de l'END comprenant à la fois commerciaux et open source. Détails sur les programmes en cours d'exécution peuvent être trouvés avec chaque emballage spécifique. Instructions générales sont donnés à chaque étape avec les commandes spécifiques pour ce logiciel. (Voir liste des matières pour plus de détails sur les logiciels utilisés dans ce protocole). Les fichiers importation en soi appropriéeéchelonnement analyse pipeline conservant scores de qualité (Qscores) pour une utilisation en lecture rognage. (Pour ce programme de exemple, sélectionnez "Importer" et sélectionnez la méthode de séquençage utilisée pour générer lit. Sélectionnez .fastq.gz lire les fichiers à importer, et de conserver Qscores à partir de fichiers en lecture .fastq coupe applications en décochant «se défaire qualité scores» sous la rubrique «Général Options '. Choisissez un emplacement pour le importée lectures et sélectionnez «Terminer».) Coupez et retenir lectures en utilisant les paramètres suivants dans un NGS analyse des données pipeline. (Pour ce programme sélectionnez 'trim séquences' sous 'END base Outils' et sélectionnez les lectures d'être taillés.) Conservez ne lit contenant scores ≥ Q30. (Pour ce programme sélectionnez «Couper l'aide des scores de qualité» et fixer la limite à 0,001.) Conserver lit seulement contenant ≤ 1 nucléotide ambiguë. (Pour ce programme, sélectionnez «Ajuster les nucléotides ambiguës et régler la'Nombre maximum d'ambiguïtés "à 1. Choisissez un emplacement pour enregistrer garni lit et sélectionnez« Terminer ».) Carte coupé lit à l'in silico bisulfite converti référence gène de 2,2. (Pour que le logiciel exemple sélectionner 'Carte Lit de Référence »sous la rubrique« END base Outils'. Sélectionnez garni indique être cartographiés et sélectionnez "Suivant". Sélectionnez la séquence de référence converti et sélectionnez «pas de masquage" sous "masquage de référence '. Sélectionnez' suivant '.) Attribuer une peine maximale pour l'inadéquation, insertions et suppressions. Réglez les paramètres tels que 100% de la longueur de lecture est nécessaire pour la carte d'identité de séquence avec 90%. Par exemple logiciels, attribuer un score de 3 pour inadéquations, insertions et suppressions. Attribuer un score de 1 pour la fraction minimum de la longueur de lecture mappé à la référence, et attribuer un score de 0,9 pour la fraction minimum d'identité entre cartographiée lire et référence. <li> Jeter ou d'ignorer non spécifique lectures mappé à la référence. Ces lectures peuvent mapper aussi bien à plusieurs régions. Par exemple le logiciel sélectionner 'Ignorer' sous 'la manipulation match non-spécifique »et sélectionnez« Suivant ». Pour la sortie d'alignement générer chaque échantillon dans un fichier indépendant. Par exemple logiciel, sélectionnez «Créer autonome lire mappages» sous «Options de sortie» et «Enregistrer» sous «la manipulation de résultats". Sélectionnez un emplacement pour enregistrer le mappage de lecture et sélectionnez «Terminer». Exécutez une variante appelant flux de travail sur le lit mappé. Pour le logiciel exemple, sélectionnez «probabiliste Variant Détection 'sous' Resequencing Analyse», sélectionnez le mappage de lecture à analyser et sélectionnez «Suivant». Sélectionnez «Ignorer matchs non-spécifiques» sous «Lire filtres» et sélectionnez «Suivant». Assurez-vous que la séquence est à un depe de ≥ 1,000 X en définissant la «couverture minimale» sous «Importance» pour 1000. Assurez-vous que la variante d'appel est présent à la fois avant et arrière lit. Par exemple logiciel, sélectionnez «Exiger la présence à la fois avant et arrière des stands» sous «filtres variante» et sélectionnez «Suivant». Export alignés, variante appelée données comme une table annoté. Par exemple logiciel, sélectionnez "Créer une table annoté» sous «Options de sortie" et sélectionnez un emplacement pour enregistrer le fichier de table de variantes. Sélectionnez «Terminer». Calculer le pourcentage 5-mC utilisant les variantes de fréquences sites CpG annotés dans la région d'intérêt à partir du fichier de table de variantes. La fréquence de la cytosine à une référence C dans CG est le pourcentage 5-mC. REMARQUE: Lorsque vous utilisez la variante appelant algorithmes pour CpG hautement méthylés de remplacer cytosines CpG avec thymines. Cela identify cytosine de l'mappée comme variantes, résultant de la fréquence de cytosine en CpG de. Déterminer l'efficacité de conversion au bisulfite (BSC) en calculant d'abord le pourcentage de C ne est pas dans les sites CpG dans la référence (C). Multiplier le pourcentage de non CpG C de par le nombre de mappé (T mp) de totale T, et diviser par le nombre total de C mappé à la référence (C MPT) de T. 100 moins la fréquence calculée est l'efficacité de conversion au bisulfite (BSC) de cette bibliothèque (équation 1). Equation 1. bisulfite de rendement de conversion. REMARQUE: Bien que les génomes de mammifères contiennent de très faibles quantités de non-CpG méthylation de cytosine (à l'exception éventuellement de cellules souches 20), les génomes des plantes contiennent une quantité importante. Afin de déterminer l'efficacité de conversion au bisulfite dans ces référee génomes, une voie appropriée pour le séquençage est une partie du génome mitochondrial ou chloroplastique génome ou des gènes non méthylées connues présentes dans les génomes végétaux 21 et calcul de l'efficacité de conversion, comme décrit ci-dessus. L'efficacité de conversion au bisulfite devrait être ≥98% dans la plupart des cas, avec de l'inconverti C pouvant découler du non méthylation CpG.