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Medizin

Gründung des Menschen Epithelial Enteroids und Colonoids von Whole Gewebe und Biopsie

Published: March 06, 2015
doi:
10.3791/52483
, , , ,
1Department of Pediatric General and Thoracic Surgery,Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 2Department of Medicine, Section of Gastroenterology and Hepatology,Baylor College of Medicine

Summary

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Abstract

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed “enteroids” when derived from small intestine and “colonoids” when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Introduction

Das Epithel des Magen-Darm-Trakt ist im ständigen Erneuerung. Dieser Prozess wird durch die Proliferation von Darmstammzellen (ISCs), die kontinuierlich zu erzeugen Nachkommen rasch ersetzen das Darmepithel, während es über dreht ausgelöst. Die proliferative Fach, umfassend die ISCs ist an der Unterseite der Krypten beschränkt. Die ISCs ergeben sich Nachkommen, die schließlich in die absorbierend oder sekretorischen Linien zu unterscheiden. Auszug aus der Krypta und auf den Zotten oder Oberflächenepithel, unterscheiden Zellen progressiv, wie sie nach oben wandern, bevor Peeling in das Lumen 1. ISCs ergeben sich alle Darmepithelzellen Zelltypen, einschließlich Enterozyten, microfold Zellen, enteroendokrinen Zellen, Becherzellen, Büschel Zellen und Paneth-Zellen. Der Doppelpunkt wird durch längliche Krypten meist Kolonozyten und Becherzellen zusammengesetzt, mit verstreuten enteroendokrinen und Büschel Zellen 2, dadurch gekennzeichnet.

Ex-vivo-cultur-Systeme bilden vielversprechendes Werkzeug für die Untersuchung ISC Wartung und Darmgewebe Homöostase. Jedoch ist es schwierig, auf Gewebekulturtechniken stützen als physiologischen Bedingungen nicht vollständig wiedergegeben, und die epithelialen Mikro oft verändert 3,4. Ein großer Fortschritt in der ISC-Feld war die Gründung der Gewebekulturtechniken zu erhalten und auszubauen einzelnen murine ISCs mit definierten Wachstumsfaktoren, die normalen Darmnischen Signale zu ersetzen. Langzeitkulturbedingungen wurden von Sato et al., In denen einzelne Krypten oder isolierten Stammzellen aus dem Darmepithel wachsen, um 3-dimensionale epithelialen Strukturen einschließlich mehrerer Krypta-ähnlichen Domänen 5-7 bilden. Diese dreidimensionale Strukturen unterziehen Spaltereignisse kontinuierlich ausbauen. Interessanterweise werden alle Darmzelle spezifisch für die Ursprungsgewebe Typen produziert und ebenso in ein Lumen 8 extrudiert. Verwendung Modifikationen dieses Systems, epithelialeOrganoide aus Magen, Dünndarm und Dickdarm erzeugt werden. Genauer epithelialen Organoiden aus dem Dünndarm sind enteroids 9, und die von dem Dickdarm sind colonoids 9,10. Diese epithelialen organoide Kultursystemen verwendet worden, um die Fähigkeit der isolierten Einzelzellen als Stammzellen in vitro zu funktionieren, damit die Prüfung der "Stammzell-Seins" isolierter Zellen 5,6,10-15 testen. Andere Forscher haben sowohl enteroids und colonoids verwendet, um die Funktion der einzelnen Epithelzellen 16-21 untersuchen. So können enteroid und colonoid Kulturen verwendet, um sowohl Stamm- und Nicht-Stammzellfunktionen zu bewerten und geben neue Einblicke in die grundlegenden zellulären Interaktionen im Darm werden.

Im Jahr 2011, Sato und Mitarbeiter erzeugten Langzeitkultur von Epithelzellen Organoide aus menschlichen Dünndarm und Dickdarm 22,23 abgeleitet. Neben Unterschieden in der Medienzusammensetzung, die menschlichen Epithelzellen enteroidsund colonoids weisen die gleichen Funktionen wie die murine Gegenstück. Weiterhin können sie aus erkrankten Geweben, wie Barrett-Ösophagus, Adenom oder Adenokarzinom und Mukoviszidose 22,24 erzeugt werden. Menschen enteroids eine wertvolle System Darmstammzellen und epithelialen Schleimhaut Biologie zu studieren und als neuartige experimentelle System, um sowohl normale und abnormale Magen-Darm-Physiologie 3 studieren.

Hier beschreiben wir Methoden, um enteroids und colonoids aus menschlichen Dünndarm und Dickdarm Krypten (Abbildung 1) zu etablieren. In diesem methodischen Überprüfung unterstreichen wir die Krypta Sammlung von ganzes Gewebe und Biopsien. Wir rekapitulieren die Kultur Modalitäten, die für die erfolgreiche Entwicklung und Pflege der menschlichen enteroids und colonoids und den von diesem Modell durchgeführt mögliche experimentelle Strategien sind.

Protocol

HINWEIS: Ethikerklärung: Alle Experimente unter Verwendung der hier in CCHMC beschrieben wurde genehmigt durch ein IRB menschlichen Geweben (IRB # 2012-2858; # 2014 bis 0427). Einverständniserklärung für die Gewebe Erhebung, Speicherung und Verwendung der Proben wurde von den Gebern auf CCHMC erhalten. 1. Vorbereitung für die Kultur HINWEIS: Alle Reagenzien werden in Tabelle 1 aufgelistet. Bereiten EDTA-Stammlösung wie folgt: Vorbereitung 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure, pH 8 (EDTA) in hochreines H 2 O, Filter mit 0,22 um Filter sterilisiert. Wahlweise lagern Sie das EDTA-Stammlösung bei RT auf unbestimmte Zeit. Bereiten chelatbildenden Puffer wie folgt: Mischung 2% Sorbit, 1% Saccharose, 1% Rinderserumalbumin, Fraktion V (BSA) und 1x Amicin / Amphotericin Lösung in Dulbeccos Phosphat-gepufferte Salzlösung ohne Ca 2+ und Mg 2+ (DPBS), sterilfiltriert mit 0,22 & mgr; m Filter. Bereiten Sie die Chelat-buffer frisch. Bereiten Wnt-3A-konditionierten Medium wie folgt: Wnt-3A-konditionierte Medium wird im Haus unter Verwendung der Zellinie L Wnt-3A nach den Anweisungen des Herstellers (ATCC, CRL-2647) hergestellt. Ergänzung des Mediums mit 2 mM Glutamin, 10 mM HEPES, 100 U / ml Penicillin, 100 g / ml Streptomycin, 1 N2 Ergänzung 1 B27 Supplement, 1% BSA und Filter mit 0,22 um-Filter sterilisiert. HINWEIS: Testen Sie jede Charge für Wnt-Aktivität mit einem TOPFLASH Assay. Verwenden Sie eine stabile HEK293 TOPFLASH Zelllinie (Hans Clevers Labor) mit einem Renilla-Luciferase-Assay-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Normalisieren der TOPFLASH Assay mit 100 ng / ml humanes rekombinantes Wnt-3A. Bestätigen eine mindestens 10-fache Veränderung der Aktivität im Vergleich zu Kontroll konditionierten Medien. Teilen frischen Wnt-3A-konditionierten Medium in 10 ml-Aliquots in 15 ml konische Röhrchen übertragen und bei -20 ° C für bis zu 6 Monate. Speicher taut Aliquots bis zu 5 Tage bei 4 ° C ohne Aktivitätsverlust. Prepare menschlichen minigut Medium wie folgt: Supplement erweiterte DMEM / F12-Medium mit 2 mM Glutamin, 10 mM HEPES, 100 U / ml Penicillin, 100 g / ml Streptomycin, 1 N2 Ergänzung 1 B27 Supplement, 1% BSA und Filter mit 0,22 sterilisiert um Filter. HINWEIS: Dividieren frischen menschlichen minigut Medium in 10 ml-Aliquots in 15 ml konische Röhrchen übertragen und bei -20 ° C für bis zu 3 Monate. Speicher taut Aliquots bis zu 5 Tage bei 4 ° C ohne Aktivitätsverlust. Bereiten vollständigen menschlichen minigut Medium wie folgt: Bereiten Sie frisch vor Krypta Kultur oder Mediumwechsel menschlichen minigut Medium (siehe 1.4) mit 50% Wnt-3A-konditioniertes Medium (siehe 1.3), 1 ug / ml R-spondin 1 (1 ergänzt: 1000 Verdünnung von 1 mg / ml Stamm), 100 ng / ml Noggin (1: 1000-Verdünnung von 100 g / ml Stamm), 50 ng / ml EGF (1: 10000 Verdünnung von 500 ug / ml Stamm), 500 nM A-83 -01 (1: 1000-Verdünnung von 500 M Lager), 10 & mgr; SB202190 (1: 3000-Verdünnung von 30 mM Stamm), 10 nM [Leu] 15-Gastrin 1 (1: 10.000-Verdünnung von 100 uMLager), 10 mM Nicotinamid (1: 100 Verdünnung von 1 M Stamm) und 1 mM N-Acetylcystein (1: 1000 Verdünnung von 1 M Stamm). HINWEIS: Shop vollständigen menschlichen minigut Medien bis zu 2 Tage bei 4 ° C ohne Aktivitätsverlust. 2. Crypt-Isolierung aus Voll Tissue HINWEIS: Von der Gewebesammlung, ist es wichtig, die Probe in Kochsalzlösung erhalten. Es wird empfohlen, um das Gewebe auf Eis während des Transports zu halten. Vorbereitung der Probe für die Isolierung von Krypta sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden. HINWEIS: Alle Reagenzien sind in Tabelle 1, Geräte, Einrichtungen aufgeführt, und Verbrauchsmaterialien sind in Tabelle 2 aufgeführt. Bereiten Sie alle Reagenzien vor dem Beginn des Experiments. Auftauen Basalmembranmatrix auf Eis und vorge inkubieren einer 24-Well-Platte in einem CO 2 Inkubator bei 37 ° C. HINWEIS: Alternativ machen Sie eine dünne Schicht Basalmembranmatrix mit 15 ul / Vertiefung in der Mitte eines 24-gut Platte und legen Sie sie in einem CO 2 Inkubator bei 37 ° C. Dieser fakultative Schritt hält den Basalmembranmatrix wie ein Tropfen während der Polymerisation. Waschen Sie das Gewebe mit eiskaltem Dulbecco phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Ca 2+ und Mg 2+ (DPBS). Gehen Sie bis der Gehalt an DPBS ist klar. Mit 0,2 mm Durchmesser minutien Stifte, sichern das Gewebe auf einem silikonbeschichteten Glaspetrischale mit eiskaltem DPBS gefüllt. Dehnen und Pin das Gewebe flach mit der Schleimhautseite nach oben. Unter einem Binokular, entfernen Sie den darüber liegenden Schleimhaut aus der Submukosa und des Bindegewebes unter Verwendung von Mikro Präparierscheren und feine Spitze gebogenen Pinzette (2A, B). Dehnen und Pin die seziert Schleimhaut flach auf dem silikonbeschichteten Glaspetrischale mit Schleimhautseite nach oben. Der verbleibende submucosa und Bindegewebe kann verworfen oder zur weiteren Experimenten (2C) verwendet werden. Sanftkratzen die Oberfläche der Schleimhaut mit einer gebogenen Pinzette. Dieser Schritt ist notwendig, um die Qualität des Präparats zu verbessern. Für Dünndarm, sanft kratzen die Schleimhaut, die Zotten zu entfernen. Für Doppelpunkt, sanft kratzen die Schleimhaut zu entfernen Schleim und Schutt. 3-4 mal Waschen Sie die Schleimhaut mit eiskaltem Chelat-Puffer, um Zotten und Schmutz zu entfernen. Decken Sie die Schleimhaut mit frisch zubereiteten 2 mM EDTA-Chelat-Puffer (200 ul 0,5 M EDTA in 49,6 ml Chelat-Puffer). Legen Sie die Petrischale auf Eis und schütteln Sie sie leicht für 30 Minuten auf einem Horizontalschüttler. 3-4 mal mit eiskaltem Chelat-Puffer ohne EDTA Waschen Sie die Gewebe. Nach dem Waschen, lassen Sie die Schleimhaut in eiskaltem Chelat-Puffer. Verarbeiten Sie die Schleimhaut unter einem Binokular mit gebogenen und feinen Pinzette. Kratzen Sie vorsichtig die Schleimhaut zu Darmkrypten mit den gebogenen Pinzette lösen. Entfernen Sie vorsichtig die Krypta Suspension aus der Petrischale mit einem piPette und übertragen sie in einem 50 ml konischen Röhrchen. HINWEIS: Überprüfen Sie die Gewebe, um sicherzustellen, dass fast alle Krypten wurden aus der Schleimhaut entfernt. Filtern Sie die Krypten Suspension durch ein 150 & mgr; m Netz 2 mal. HINWEIS: Überprüfen Sie die Durchfluss für Krypta Bereicherung unter dem Mikroskop (2D). Zentrifugieren Sie die Krypta Suspension 5 min bei 50 × g, 4 ° C. Überstand verwerfen. Das Pellet in 5 ml eiskaltem Chelat-Puffer. Die Anzahl der Krypten pro 10 ul Tropfen aus der Suspension aus Schritt 2.15. Übertragen der Anzahl von Krypten zum Plattieren auf eine 5-ml-Rundrohr benötigt. Verwenden 200-500 Krypten pro Vertiefung einer 24-Well-Gericht zu enteroids oder colonoids etablieren. Zentrifugieren Sie die Krypta Bruchteil für 10 Minuten bei 150 g, 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand. Verwenden Krypten für nachfolgende Kultur. 3. Crypt Isolation von Biopsie Bereiten Sie alle Reagenzien vor derzu Beginn des Experiments. Auftauen Basalmembranmatrix auf Eis und vorge inkubieren einer 24-Well-Platte in einem CO 2 Inkubator bei 37 ° C. Waschen Sie die Biopsie mit eiskaltem Dulbecco phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Ca 2+ und Mg 2+ (DPBS). Mit 0,1 mm Durchmesser minutien Stifte, sichern Sie die Biopsie auf einem silikonbeschichteten Glaspetrischale mit eiskaltem DPBS gefüllt. Dehnen und stecken die Schleimhaut flach mit der Schleimhautseite nach oben (Abbildung 2E). Kratzen sanft über die Oberfläche der Schleimhaut mit einer gebogenen Pinzette zu Zotten und Schmutz zu entfernen. Dieser Schritt ist notwendig, um die Qualität des Präparats zu verbessern. 3-4 mal Waschen Sie die Biopsie mit eiskaltem Chelat-Puffer, um Zotten und Schmutz zu entfernen. Decken Sie die Biopsie mit frisch zubereiteten 2 mM EDTA-Chelat-Puffer (200 ul 0,5 M EDTA in 49,8 ml Chelat-Puffer). Legen Sie die Petrischale auf Eis und schütteln Sie sie leicht für 30 Minuten auf einem Horizontalschüttler. <li> 3-4 mal mit eiskaltem Chelat-Puffer ohne EDTA Waschen Sie die Biopsie. Nach dem Waschen, lassen Sie die Biopsie in eiskaltem Chelat-Puffer. Verarbeiten Sie die Biopsie unter einem Binokular mit gebogenen und feinen Pinzette. Sanft kratzen die Schleimhaut, die Darmkrypten frei mit einer gebogenen Pinzette. Entfernen Sie vorsichtig die Krypta Suspension aus der Petrischale mit einer Pipette und überträgt es auf einem 50 ml konischen Röhrchen. HINWEIS: Überprüfen Sie die Gewebe, um sicherzustellen, dass fast alle Krypten wurden aus der Schleimhaut entfernt. Filter die Krypta Suspension durch ein 150 & mgr; m Nylon Netz 2 mal. HINWEIS: Überprüfen Sie die Durchfluss für Krypta Bereicherung unter dem Mikroskop. Zentrifugieren Sie die Krypta Suspension 5 min bei 50 × g, 4 ° C. Überstand verwerfen. Das Pellet in 1 ml eiskaltem Chelat-Puffer. Übertragen der Krypta Suspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Krypta Bruchteil für 10 Minuten bei 150 × g, 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand. </ Li> Verwenden Krypten für nachfolgende Kultur. 4. Crypt Kultur in Basalmembranmatrix Mit vorgekühlte Pipettenspitzen, resuspendieren Krypta Pellet (aus Schritt 2.18 oder 3.15) in Basalmembranmatrix (200-500 Krypten / 50 ul Basalmembranmatrix). Übernehmen 50 ul der Krypta Suspension in Basalmembranmatrix pro Vertiefung auf dem vorgewärmten Teller. Langsam werfen Sie die Basalmembranmatrix in der Mitte des Brunnens. Platzieren Sie die 24-Well-Platte in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator für 30 Minuten, um eine vollständige Polymerisation des Basalmembran-Matrix zu ermöglichen. Überlagern die Basalmembran-Matrix mit 500 ul vollständigen menschlichen minigut Medium mit 2,5 uM CHIR99021 ergänzt (1: 4000 Verdünnung von 10 mM Stamm) und 2,5 uM Thiazovivin (1: 4000 Verdünnung von 10 mM Stamm). Inkubieren der Platte bei 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. Ersetzen Sie das Medium durch frisches Komplett human minigut Medium alle 2 Tage. 5. Passagieren der kultivierten Enteroids und Colonoids. HINWEIS: Passage Enteroids und Colonoids alle 7 bis 10 Tage nach der ersten Beschichtung. Im Allgemeinen aufgeteilt einem gut in 3-4 Brunnen. Bereiten Sie alle Reagenzien vor dem Beginn des Experiments. Auftauen Basalmembranmatrix auf Eis und vorge inkubieren einer 24-Well-Platte in einem CO 2 Inkubator bei 37 ° C. Entfernen Sie die Medien Gebrauch steriler Pipettenspitzen und Überlagerung mit 1 ml eiskaltem DPBS. Pipette hin und her mit einem 1000 ul Spitze. Die Lösung wird in ein neues 15 ml konischen Röhrchen. 2 ml menschliche minigut Medium mit 5% FBS pro 1 ml Medium, ergänzt. Zentrifugieren Sie die Lösung für 5 min bei 50 × g, 4 ° C. Überstand verwerfen. Das Pellet mit 2 ml Zelldissoziation Enzym mit 10 & mgr; Y-27632 ergänzt (1: 1000 Verdünnung von 10 mM Stamm). Inkubationszeit von 5 min bei 37 ° C in einem Wasserbad. Distanzieren die Zellklumpen mit einem 3 ml Luer-Lock-Spritze mit einer 18-G Füll- / stumpfe Nadel ausgestattet. Pipette vorsichtig die Lösung hin und her mit der Spritze 10 mal. Zentrifugieren Sie die Suspension für 5 Minuten bei 500 × g, 4 ° C. Überstand verwerfen. Mit vorgekühlte Pipettenspitzen, Zellpellet in Basalmembranmatrix. Übernehmen 50 ul der Krypta Suspension in Basalmembranmatrix pro Vertiefung auf dem vorgewärmten Teller. Langsam werfen Sie die Basalmembranmatrix in der Mitte des Brunnens. Platzieren Sie die 24-Well-Platte in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator für 20 Minuten, um eine vollständige Polymerisation des Basalmembran-Matrix zu ermöglichen. Überlagern die Basalmembran-Matrix mit 500 ul vollständigen menschlichen minigut Medium mit 10 & mgr; Y-27632 ergänzt (1: 1000 Verdünnung von 10 mM Stamm). Inkubieren der Platte bei 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. Nach 2 TagenErsetzen Sie das Medium mit frischem vollständigen menschlichen minigut Medium mit 10 & mgr; Y-27632 ergänzt (1: 1000 Verdünnung von 10 mM Stamm). Danach setzen Sie die Medium mit frischen, ganzen Menschen minigut Medium jeden zweiten Tag. 6. Einfrieren von Cultured Enteroids und Colonoids HINWEIS: Normalerweise frieren ein Bohrloch in 2-3 Kryoröhrchen. Wiederholen Sie die Schritte 5.1 bis 5.8. Das Pellet mit kaltem Einfriermedium. 1 ml der Frierlösung in ein beschriftetes Kryovial. Platzieren Sie die Kryoröhrchen in einen Gefrierbehälter mit 500 ml Isopropylalkohol. Übertragen des Gefrierbehälters zu einer 80 ° C Gefrierschrank für 24 h, dann Transfer Kryoröhrchen in flüssigen Stickstoff Lagerung. HINWEIS: Shop Enteroids und Colonoids für bis zu 1 Jahr.

Representative Results

2D zeigt ein typisches Beispiel einer frisch isolierten Krypten aus ganzem Gewebe (Figur 2D). Die Anzahl der Krypten aus einer Biopsie isoliert ist geringer als im gesamten Gewebe. Mit Standard-Kapazität Biopsiezange mit Nadel, die wir in der Regel führen zwei Biopsie beißt auf einem einzigen Durchgang. Jede Biopsie Biss zu einer 10 mm 2 Oberfläche mit einem Durchschnitt von 50 bis 100 Krypten pro Biopsie (2F). Nach Kultur in Basalmembranmatrix, die Krypten runden den enterospheres für Dünndarm und Dickdarm colonospheres für zu bilden. Die Krypta angeh tritt in der Regel innerhalb von 5-6 Tagen nach der Aussaat. Es ist jedoch nicht ungewöhnlich, dass entweder enteroids (enteroids) oder colonoids (colonoids) Bilden Kugeln im Basalmembranmatrix siehe (3A-C; Film 1). Die Passage kann nach 7 Tagen durchgeführt werden, abhängig von der Größe der enteroids. Die enteroids oder colonoids establaus Biopsien Ished laufen die gleiche Entwicklung in der Kultur. Da jedoch die Krypta Dichte bei der Aussaat niedriger ist, die Passage ist in der Regel nach 10 bis 12 Tagen in Kultur durchgeführt (Abbildung 4a, b). Enteroids und colonoids Kulturen erweitern reproduzierbar. Beide enteroids und colonoids präsentieren eine luminale Seite und mit einem Epithel (5A, B). Proliferativen Zellen können innerhalb der enteroids beobachtet werden und sind innerhalb der Knospenspitzen (5C, D) befindet. Konfokale Bildgebung von enteroids mit E-Cadherin (ECAD) gefärbt sind die Epithelzellen (5E). Beide enteroids und colonoids aus von Patienten mit genetischen / Erbkrankheiten erhalten Gewebe hergestellt werden. Abbildung 6 zeigt repräsentative enteroids wachsenden von einem Patienten mit zystischer Fibrose (6A) und eine Tufting-Enteropathie aufgrund einer angeborenen Mutation im Epithelzellen admenhalt Molekül Gen (EpCAM) (6B). Neben der genetischen Defekt, werden die enteroids zeigen keine Unterschiede in den basalen Zustand. Abbildung 1. Arbeitsablauf der Krypten Dissoziation und Herstellung von menschlichen enteroids und colonoids in der Kultur. Krypten (aus menschlichen Dünndarm oder Dickdarm) sind je nach EDTA-Chelat-isoliert. Kultivierte Krypten bilden enteroids für den Dünndarm und colonoids für den Dickdarm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. Abbildung 2. Dissection Verfahren zur Krypta Isolation. (A) Der Dünndarm specimen gestreckt und flach in eine mit Silikon beschichtete Petrischale angeheftet. (B) wird die Schleimhaut von der zugrunde liegenden Submukosa getrennt. (C) Das seziert Schleimhaut gestreckt und flach in einen silikonbeschichteten Petrischale fixiert. (D) Nach der Chelat EDTA werden die Krypten aus dem Gewebe isoliert. (E) Eine Biopsie gestreckt und flach in eine mit Silikon beschichtete Petrischale angeheftet. (F) Nach dem EDTA-Chelat, Krypten aus dem Biopsie isoliert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. Abbildung 3. Crypt Kultur und Menschen enteroid und colonoid Generation von ganzen Gewebe. (A) Jejunal Krypten in Basalmembranmatrix nach der Isolierung überzogen. Die Krypten sind Schluss bis nach 3 bis 4 Stunden und beginnen, Ballon bis zu enterospheres über diesen Zeitraum hinaus zu bilden. Bei 7 Tagen werden die jejunal enteroids gebildet. (B) Nach der Isolierung und Kultur, Ileum Krypten verhalten sich wie die jejunal Krypten und bilden Ileum enteroids. (C) Kolonkrypten in Basalmembranmatrix nach der Isolierung überzogen. Die Krypten der Nähe und Form colonoids nach 7 Tagen (Maßstabsbalken: 100 um). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. Abbildung 4. Crypt Kultur und Menschen enteroid und colonoid Generation von Biopsie. (A) Duodenal Krypten in Basalmembranmatrix nach der Isolierung überzogen. Die Krypten sind Schluss bis nach 3 bis 4 Stunden und beginnen, Ballon bis beyond dieses Mal zu enterospheres bilden. Bei 7 Tagen werden die enteroids gebildet. (B) Nach der Isolierung und Kultur, sind Kolonkrypten in Basalmembranmatrix überzogen. Die Krypten hautnah zu colonospheres bilden dann colonoids nach 7 Tagen (Maßstabsbalken: 100 um). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. Abbildung 5. Darm Linien der menschlichen enteroids. (A) Menschen enteroid nach 6 Tagen in Kultur. (B), Hämatoxylin-Eosin-Abschnitten der enteroids in (A) zeigen die epitheliale Auskleidung (Maßstabsbalken: 100 um). (CD) die konfokale Abbildung enteroids nach EdU Färbung (magenta) zeigt die Anwesenheit von proliferativen Zellen. (E </strong>) Die konfokale Bildgebung von enteroids zeigt die Anwesenheit von: E-Cadherin für Epithelzellen (ECAD, grün) (Maßstab. 50 um) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. Abbildung 6. Crypt Kultur und Menschen enteroid Generation von erkranktem Gewebe. (A) Enteroids aus einer Mukoviszidose Probe etabliert. (B) Enteroids von einem angeborenen Tufting-Enteropathie Probe festgelegt (Maßstabsbalken: 100 um). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. Film 1. Enterosphere enden menschlichen enteroid in Kultur. 32 Stunden Zeit-Rundene-Film zeigt eine enterosphere aus menschlichen Dünndarm Zurückziehen eine enteroid in Kultur bilden etabliert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. Name des Reagenz Unternehmen Katalog-Zahl Lösungsmittel Lizenz Konzentration Endkonzentration Kommentar Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung Ca 2+, Mg 2+ frei (DPBS) Life-Technologien; Gibco 14190-144 – – 1x Ethylendiamin tetraessigsäure (EDTA) Sigma-Aldrich 431.788 Ultrapure dH 2 O <td> 0,5 M 2 mM Sorbitol Fischer Scientific BP439-500 DPBS Pulver 2% Saccharose Fischer Scientific BP220-1 DPBS Pulver 1% Rinderserumalbumin (BSA), Fraktion V Fischer Scientific BP1600-100 DPBS Pulver 1% Gzntamycin / Amphotericin B-Lösung Life-Technologien; Gibco R-015-10 – 500x 1x Wnt-3A conditionned Medium im Haus – – – – Erweiterte DMEM / F12 Life-Technologien; Gibco 12634-028 – – – HEPES 1M Life-Technologien; Gibco 15630-080 – 1 M 10 mM GlutaMAX (Glutamin) Life-Technologien; Gibco 35050-061 – 100X 1X Penicillin-Streptomycin (10.000 U / ml) Life-Technologien; Gibco 15140-148 – 100X 1X N2 Supplement Life-Technologien; Gibco 17502-048 – 100X 1X B27 Supplement Life-Technologien; Gibco 17504-044 – 50X 1X N-Acetylcystein Sigma-Aldrich A9165-5G DPBS 1 M 1 mM </td> Nicotidamide Sigma-Aldrich N0636 DPBS 1 M 10 mM Matrigel, GFR, Phenol frei (Basalmembranmatrix) Corning 356.231 – – – ERFORDERLICH menschlicher rekombinanter Noggin F & E- 6057-NG / CF DPBS 100 & mgr; g / ml 100 ng / ml Andere Anbieter: F & E; Anaspec und Preprotech humanen rekombinanten R-Spondin Preprotech 120-38 DPBS 1 mg / ml 1 & mgr; g / ml humanes rekombinantes EGF Sigma-Aldrich E9644-.2MG DBPs 500 & mgr; g / ml 50 ng / ml Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503-1MG DPBS 10 mM 10 & mgr; M A-83-01 Tocris 2939 DMSO 500 & mgr; M 500 nM SB202190 Sigma-Aldrich S7067-5MG DMSO 30 mM 10 & mgr; M Menschen [Leu] 15-Gastrin 1 Sigma-Aldrich G9145-.1MG DPBS 100 & mgr; M 10 nM CHIR99021 Stemgent 04-0004 DMSO 10 mM 2,5 & mgr; M Thiazovivin Stemgent 04-0017 DMSO 10 mM 2,5 & mgr; M TrypLE Express Enzyme (1X), Phenolrot (Zelldissoziationslösung Enzym) Life-Technologien; Gibco 12605-010 – – – Für Passagieren Fötales Rinderserum Life-Technologien; Gibco 10082-147 – – – Für Passagieren CTS Synth-a-Freeze-Medium (Gefriermedium) Life-Technologien; Gibco A13713-01 – – – Zum Einfrieren L Wnt-3A-Zelllinie ATCC CRL-2647 – – – Wnt-3A conditionned Medienproduktion Renilla-Luciferase-Assay Promega E2710 – – – Wnt-3A conditionned-Media-Aktivitäten humanen rekombinanten Wnt-3A F & E- 5036-WN / CF DPBS 100 & mgr; g / ml 100 ng / ml <td> Wnt-3A conditionned-Media-Aktivitäten HEK293 TOPFLASH Zelllinie – – – – – Wnt-3A conditionned-Media-Aktivitäten; Geschenk von Hans Clevers Labor Tabelle 1. Detaillierte Reagenzienliste mit bevorzugten Herstellers und Katalognummer. Ausrüstung Verbrauchsgut Extras Laminarströmungshaube 15- und 50 ml konische Röhrchen Dumont # 5 Standard-Pinzette (FST; # 11.251-20) CO 2 Inkubator Mikrozentrifugenröhrchen Dumont # 7, gebogen feinen Pinzette (FST; # 11.274-20) Stereo-Mikroskop Platten mit 24 Vertiefungen Feine Schere (FST; # 14.060-09) <tr> Zentrifuge 0,22 um Filter (Sartorius) Vannas Frühjahr Schere (FST; # 15.018-10) Kreisschüttler Serologische Pipetten 0,2 mm Durchmesser minutien Stifte (FST; # 26.002-20) Gefrierbehälter (Nalgene) Mikropipettenspitzen 0,1 mm Durchmesser minutien Stifte (FST; # 26.002-10) Sylgard 184 Silikon (Dow Corning) 150 & mgr; m Maschenweite, Nylon-Screening (Dynamic Aqua-Versorgung) Glaspetrischale 5 ml Rundbodenpolypropylenröhrchen (Falcon) Serologische Pipette 18G stumpfen Füllnadel (BD) Mikropipette 3 ml lsyringes mit Luer-Lock-Tipps (BD) Kryoröhrchen <strong> Tabelle 2. Detaillierte Verbrauchsmaterialien, Werkzeuge und Geräte für die Krypta Isolierung und Kultivierung benötigt.

Discussion

Diese Methode bietet ein komplettes System reproduzieren Darmepithelzellen Linien und epithelialen Dynamik, die ein nützliches Instrument, um Darmepithelzellen Biologie studieren bilden. Die hier vorgestellte Methode wurde von der ursprünglichen Maus-Studie, die von Sato und Clevers 22, die effizient führt zu menschlichen enteroids und colonoids angepasst. Hier haben wir von Hand hob die Krypten durch Mikrodissektion, alle zellulären Verunreinigungen zu vermeiden. Diese Methode ermöglicht eine direkte Visualisierung der Krypten und führt zu einer Konsistenz von Überstunden im Vergleich zum ursprünglichen Krypta Sammlung durch "Schütteln". Andere Gruppen entwickelt ähnliche Technik mit leicht unterschiedlichen Ansätze vor allem Austausch der Chelat von EDTA mit Collagenase 25. Neben den Unterschieden in Krypta Sammlung, diese Technik mit einem definierten Medien, die erforderlich sind, um die menschliche enteroids in Kultur 22 wachsen. Um das Wachstum Effizienz bei Krypta Aussaat zu erhöhen, haben wir ein GSK3-Inhibitor hinzufügen (CHIR99021)in den ersten beiden Tagen 12.

Die Handhabung des Gewebes oder Biopsien ist wichtig und die Krypta Isolierung sollte, sobald das Gewebe gelangt im Labor durchgeführt werden. Allerdings könnte verzögert Krypta Isolierung und Kultivierung von bis zu 24 Stunden nach der Gewebesammlung durchgeführt werden (Daten nicht gezeigt), wie zuvor für murinen Gewebe 26 beschrieben. Das Darmgewebe ist in einem konischen Rohr vollständig mit DPBS gefüllte Gewebezerstörung zu vermeiden, und bei 4 ° C gehalten werden, aufgestellt werden. Die verzögerte Vorbereitung ermöglicht Gewebe Verschiffen aber Temperaturschwankungen sollten während des Transports zu vermeiden. Die Gesamtzeit für die ursprüngliche Krypta Beschichtung benötigt wird, ist ca. 2 h bei 15 bis 30 Minuten, um das Gewebe und 1 bis 2 Stunden zu isolieren und die Platte die Krypta zu verarbeiten. Die Mikrodissektion des Gewebes ist ein kritischer Faktor und Prädikat eines sauberen Krypta Zubereitung. Allerdings ist die Krypta Freigabe durch Händeschütteln in verschiedenen Protokolle beschrieben möglich 22,23.

Trotz der Ähnlichkeiten mit dem murinen enteroid (enteroids) System, die menschliche enteroids erfordern spezifische Moleküle zu fördern und zu erhalten ihr Wachstum im Laufe der Zeit. Die Wachstumsfaktoren sind EGF Noggin, R-spondin ähnlich wie die murine Epithelzellen Organoide verwendet. Jedoch ist die Verwendung von Wnt-3A kritisch. Wir haben festgestellt, dass die Bildung als auch die Wachstumseffizienz größer Verwendung eines Wnt-3A konditionierten Medium als das menschliche rekombinante Protein. Begleitend haben wir gezeigt, verbesserte Kulturbedingungen unter Verwendung eines Inhibitors der Glycogensynthasekinase 3 (CHIR99021) 12. Rekombinante Wachstumsfaktoren könnte durch Wnt-3A, R-spondin und Noggin Anlage-Medien ersetzt werden. A Wnt-3A-exprimierenden L-Zelllinie ist im Handel erhältlich (ATCC). Andere Gruppen haben R-spondin 1- 23,27, Noggin- 19 entwickelt und Wnt-3A / R-spondin3 / Noggin- 28 exprimierenden Zelllinien. Zwei kleine Molekül-Inhibitoren sind in der Kultur verwendet michdia und sind für die Aufrechterhaltung der Kultur 29 notwendig. A-83-01 ist ein selektiver Inhibitor des transformierenden Wachstumsfaktors β und Activin / Nodal Rezeptoren (Activin-like kinase 4, 5, 7) und SB202190 ist ein p38 mitogen-aktivierte Proteinkinase-Inhibitor (MAPK). Beide Inhibitoren wurden jeweils verwendet, um menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen Selbsterneuerung zu erhalten und die menschliche naiv pluripotenten Stammzellen 30-32 etablieren. Auch Nicotinamid, ein Vorläufer von Nicotinamidadenindinucleotid, ist erforderlich, um enteroids und colonoids Expansion in einer langfristigen Weise 22,29 aufrechtzuerhalten.

Die EDTA-Chelat ist ein wichtiger Schritt, da sie die Ausbeute von Krypta Zubereitung bestimmt. Wir waren mit 2 mM EDTA Behandlung erfolgreich. Jedoch können EDTA-Konzentration von 2 mM bis 15 mM in Bezug auf die Art des Gewebes, modifiziert werden. In diesem Fall muss die Inkubationszeit empirisch ermittelt werden. Nach der ersten Beschichtung wird die Krypta runden-up und bilden schließlich enteroids. Allerdings sind die enteroids oder colonoids zeigen oft einen "Stamm" Phänotyp durch Bildung von Kugeln mit wenig bis gar keine differenzierten Zellen. In diesem Fall kann die Differenzierung durch Abziehen Wnt-3A, Nicotinamid und das p38-MAPK-Inhibitor ausgelöst werden. Die Verwendung von Notch-Inhibitor, wie DAPT oder DBZ hilft Verbesserung der Differenzierung innerhalb der enteroids 22.

Dieses Modell rekapituliert die Darmphysiologie mit kontinuierlichen Krypta-angehende Ereignisse, die sich aus einer Stammzelle Fach sowie villus artigen epithelialen Domänen, die sowohl Absorptions- und sekretorischen differenzierten Linien. Interessanterweise hat das System keine mesenchymalen Zellen enthalten, und ein bestimmter Datenträger verwendet Bedingungen, um die Nische Signalanforderungen zu erfüllen.

Wie das Mausmodell kann menschliche enteroids aus isolierten Darmepithelzellen erzeugt werden, um die Kapazität dieser Zellen als Stammzellfunktion zu testen. Several Studien Cluster von Differenzierungsmarker (CD44, CD24 oder CD166) und EPHB2 positiven Zellen verwendet werden, um Zellen mit Stamm Eigenschaften 12,23,33 bereichern. Zusammen zeigen diese Studien zeigen die Nützlichkeit der menschlichen enteroids Kulturen zum Testen der stemness. Andere Forscher sind mit diesem Modell zu Darmerkrankungen wie infektiöse Durchfallerkrankungen, zystische Fibrose, oder Darmkrebs 22,34-37 zu untersuchen. Diese Studien zeigen, dass das menschliche enteroids bilden eine zuverlässige menschlichen Krankheitsmodell mit der Möglichkeit, auf eine persönliche Vorführung zu bewegen. Menschliche enteroids genetisch modifiziert werden unter Verwendung von DNA-Transfektion oder Infektion mit Viruspartikeln 38. Dies bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um Gen-spezifische Funktionen innerhalb der humanen epithelialen Organoide oder richtige genetische Mutationen zu untersuchen. Vor kurzem Schwank und Kollegen gezeigt, die Möglichkeit, das Genom mit dem CRISPR / Cas9 System bearbeiten und korrigieren Sie die Mutation des CFTR-Gens verursacht acystic Fibrose 24. Menschliche enteroids eine wertvolle System Darmstammzellen und epithelialen Schleimhaut Biologie studieren und dienen als neue experimentelle System, sowohl normale als auch abnormale gastrointestinalen Physiologie zu untersuchen.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We gratefully acknowledge Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands) for the kind gift of TOPflash cells.

This project was supported in part by NIH-R01DK083325 (MAH); NIH P30 DK078392 (Digestive Health Center); NIH UL1RR026314 (CTSA).

Materials

Name of Reagent Company Catalog Number
Dulbecco’s Phosphate buffered saline Ca2+, Mg2+ free (DPBS) Life technologies; Gibco 14190-144
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich 431788
Sorbitol Fischer Scientific BP439-500
Sucrose Fischer Scientific BP220-1
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V Fischer Scientific BP1600-100
Gzntamycin/Amphotericin B solution Life technologies; Gibco R-015-10
Wnt-3A conditionned medium in house –
Advanced DMEM/F12 Life technologies; Gibco 12634-028
HEPES 1M Life technologies; Gibco 15630-080
GlutaMAX (glutamine) Life technologies; Gibco 35050-061
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Life technologies; Gibco 15140-148
N2 Supplement Life technologies; Gibco 17502-048
B27 Supplement Life technologies; Gibco 17504-044
N-Acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-5G
Nicotidamide Sigma-Aldrich N0636
Matrigel, GFR, Phenol free (basement membrane matrix) Corning 356231
human recombinant Noggin R&D 6057-NG/CF
human recombinant R-Spondin Preprotech 120-38
human recombinant EGF Sigma-Aldrich E9644-.2MG
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503-1MG
A-83-01 Tocris 2939
SB202190 Sigma-Aldrich S7067-5MG
human [Leu]15-Gastrin 1 Sigma-Aldrich G9145-.1MG
CHIR99021 Stemgent 04-0004
Thiazovivin Stemgent 04-0017
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red (cell dissociation enzyme) Life technologies; Gibco 12605-010
Fetal Bovine Serum Life technologies; Gibco 10082-147
CTS Synth-a-Freeze Medium (freezing medium) Life technologies; Gibco A13713-01
L Wnt-3A cell line ATCC CRL-2647
Renilla luciferase assay Promega E2710
human recombinant Wnt-3A R&D 5036-WN/CF
HEK293 TOPflash cell line – –
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Referenzen

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Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy. J. Vis. Exp. (97), e52483, doi:10.3791/52483 (2015).
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