从整体组织和活检建立人类上皮Enteroids和Colonoids的

注：伦理学声明：在使用CCHMC本文所述被批准的IRB人体组织的所有试验（IRB＃2012年至2858年;＃2014-0427）。从供体处CCHMC获得用于组织收集，储存和使用的样本的知情同意书。 1.准备文化注：所有试剂都列在表1中 。 准备EDTA原液如下：准备0.5M的乙二胺四乙酸，pH值为8（EDTA）在超纯H 2 O，过滤消毒用0.22微米的过滤器。可选，存储EDTA原液在室温下去。 制备螯合缓冲如下：混合2％山梨糖醇，1％蔗糖，1％牛血清白蛋白组分V（BSA）和1×庆大霉素/在Dulbecco氏磷酸盐两性霉素溶液缓冲盐水不含Ca 2+和Mg 2+（DPBS），过滤灭菌与0.22微米的过滤器。准备螯合BUFFER新鲜。 制备的Wnt-3A条件培养基如下：的Wnt-3A条件培养基是使用细胞线L的Wnt-3A根据制造商的说明（ATCC，CRL-2647），制成在内部。补充了2mM谷氨酰胺，10毫米的HEPES，100U / ml的青霉素，100μg/ ml链霉素，1 N2添加剂，1 B27添加剂，1％BSA和过滤灭菌用0.22μm的过滤器中的介质。 注：测试每一批的使用TOPFLASH试验的Wnt活性。根据制造商的说明使用稳定的HEK293 TOPFLASH细胞系（汉斯Clevers实验室）与Renilla荧光素酶测定试剂盒。正常化用100ng / ml人重组Wnt-3A的TOPFLASH测定。确认至少有10倍的变化与对照组相比的条件培养基的活性。分新鲜的Wnt-3A条件培养基到10ml等份在15ml锥形管中，并冷冻在-20℃下进行长达6个月。商店解冻等分长达5天4°C时不丧失活性。 公关epare人类minigut介质如下：补编高级DMEM / F12与2mM谷氨酰胺，10mM的HEPES，100U / mL的青霉素，100μg/ mL链霉素，1 N2添加剂，1 B27添加剂，1％BSA和过滤介质灭菌0.22微米的过滤器。 注：在-20℃下进行长达3个月除以新鲜人minigut介质到10ml等分试样在15ml锥形管中并冷冻。商店解冻等分长达5天4°C时不丧失活性。 制备完整的人minigut介质如下：准备隐窝培养物或培养基改变人类minigut介质（见1.4），补充了50％的Wnt-3A条件培养基（见1.3），1微克/毫升的R-脊椎蛋白1（1前新鲜：1000稀释1毫克/毫升的股票），100毫微克/毫升的头蛋白（1：1000稀释100克/毫升的股票），50 ng / mL的EGF（1：10,000稀释500微克/毫升的股票），500 Nm的-83 ，10μMSB202190：（稀释500兆库存1000 1）（1：3000稀释的30mM库存）-01，10nM的〔亮氨酸〕15胃泌素1（1：10,000稀释的100μM的股票），10毫烟酰胺（1：稀释100 1M的股票）和1mM的N-乙酰半胱氨酸（1：1000稀释的1M股票）。 注：存储完整的人类minigut媒体2天，4℃而不丧失活性。 从整个组织2地穴隔离注意：从组织采集，它是必不可少的，以保持在盐水中的样品。建议保持组织上的冰块在运输过程中。应尽快进行样品地穴隔离的准备。 注：所有试剂都列在表1中 ，工具，设备和消耗品列于表2。 在开始实验前准备好所有的试剂。解冻在冰上和基底膜基质预先孵育，在37℃在CO 2培养箱24孔板中。 注：另外，用15微升/孔的24的中心作出的薄层基底膜基质的-嗯板，并将其放置在CO 2培养箱中在37℃。此兼性步骤保持基底膜基质作为聚合过程中下降。 与洗组织冰冷Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水不含Ca 2+和Mg 2+（DPBS）。继续进行直到DPBS的内容是清楚的。 用0.2毫米直径minutien销，固定在组织上的硅氧烷涂层玻璃培养皿填充用冰冷的DPBS。伸展和针组织扁平的粘膜面朝上。 在解剖显微镜下，从粘膜下层和结缔组织使用微解剖剪和细点弯钳除去覆粘膜（ 图2A，B）。 伸展和针的解剖粘膜平放在硅氧烷涂覆玻璃培养皿与粘膜面朝上。剩余的粘膜下层和结缔组织可以被丢弃或者用于进一步的实验（ 图2C）。 平缓刮掉粘膜与弯钳的表面上。这一步是必要的，以改善该制剂的质量。 对于小肠，轻轻刮去粘膜去除绒毛。 对于结肠，轻轻刮去粘膜去除粘液和碎屑。 用冰冷的缓冲螯合洗粘膜3-4次，以除去绒毛和碎片。 盖上新鲜烹制2mM的EDTA螯合缓冲（200微升0.5M的EDTA在49.6毫升螯合缓冲）的粘膜。 广场上冰的培养皿中轻轻摇晃在水平轨道摇床30分钟。 洗组织3-4次，用冰冷的缓冲螯合无EDTA中。在洗涤后，离开粘膜冰冷螯合缓冲器。 处理使用弯曲和细镊子解剖显微镜下的粘膜。轻轻刮去黏膜释放使用弯钳肠腺。 轻轻用圆周率从培养皿去除隐窝悬浮佩特并转移到一个50ml锥形管中。 注：检查组织，以确保几乎所有的隐窝已从粘膜去除。 通过150微米过滤隐窝暂停网2倍。 注意：检查显微镜（ 图2D）下流通的地穴富集。 离心地穴暂停5分钟50 XG，4℃。弃去上清液。 重悬在5ml冰冷缓冲螯合沉淀。 从步骤2.15计数每从悬浮液10微升滴隐窝数。转移所需要的电镀到5毫升的圆底管隐窝数。使用24孔盘200〜500隐窝每口井建立enteroids或colonoids。 离心机地下室部分为10分钟，在150克，4℃。去除上清。 使用隐窝后续文化。 从活检3.地穴隔离准备前的所有试剂开始实验。解冻在冰上和基底膜基质预先孵育，在37℃在CO 2培养箱24孔板中。 与洗活检冰冷Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水不含Ca 2+和Mg 2+（DPBS）。 使用直径0.1mm minutien销，固定在活检上硅氧烷涂层玻璃培养皿填充用冰冷的DPBS。伸展和针粘膜平与粘膜一侧朝上（ 图2E）。 轻轻刮去黏膜弯钳的表面，以去除绒毛和碎片。这一步是必要的，以改善该制剂的质量。 用冰冷的缓冲螯合洗活检3-4次，以除去绒毛和碎片。 盖上新鲜烹制2mM的EDTA螯合缓冲（200微升0.5M的EDTA在49.8毫升螯合缓冲）活检。 广场上冰的培养皿中轻轻摇晃在水平轨道摇床30分钟。 <LI>洗净切片3-4次用冰冷的螯合缓冲无EDTA。洗涤后，将留在冰冷的缓冲螯合活检。 处理使用弯曲和细镊子解剖显微镜下的活检。轻轻刮去粘膜用弯钳松开肠腺。 轻轻用移液管从培养皿中去除隐窝悬浮并转移到50ml锥形管中。 注：检查组织，以确保几乎所有的隐窝已从粘膜去除。 过滤器通过一个150微米的尼龙地穴悬吊网2倍。 注意：检查在显微镜下的流过的地穴富集。 离心地穴暂停5分钟50 XG，4℃。弃去上清液。 重悬在1ml冰冷缓冲螯合沉淀。转让墓穴悬挂到1.5 ml离心管。 离心机地穴分数在150 XG，4℃，10分钟。去除上清。</ li> 使用隐窝后续文化。 4.地穴文化基底膜基质采用预冷枪头，悬浮颗粒隐窝（从步骤2.18或3.15）在基底膜基质（200〜500隐窝/ 50微升基底膜基质）。 申请50微升隐窝悬浮液以每孔基底膜基质上的预热板。慢慢喷射在井的中心基底膜基质。 将24孔板在37℃，5％CO 2的培养箱中30分钟，以使基底膜基质的完全聚合。 覆盖基底膜基质用500微升完整的人类minigut介质中添加2.5μMCHIR99021（1：4000稀释10毫米股票）和2.5μMThiazovivin（1：4000稀释10毫米股票）。 孵育所述板在37℃，5％CO 2的培养箱中培养。 用新鲜完整的呼玛更换介质ñminigut中每2天。 5.传代培养Enteroids和Colonoids的。 注：通道Enteroids和Colonoids初步电镀后，每7〜10天。通常，分割1以及3〜4个孔。 在实验开始前，准备所有试剂。解冻在冰上和基底膜基质预先孵育，在37℃在CO 2培养箱24孔板中。 使用无菌针头和覆盖用1毫升冰冷的DPBS中取出介质。 吸管来回1000微升提示。转移在一个新的15毫升锥形管中的溶液中。 加入2 ml人minigut培养基补充有每1ml培养基中的5％FBS中。 离心5分钟，该溶液在50×g离心，4℃。弃去上清液。 重悬沉淀用2ml的细胞解离酶补充有10μM的Y-27632（1：1000稀释的10mM储备）。孵育，持续5分钟在37℃在水 – 浴中。 分离使用3毫升鲁尔锁注射器配备了一个18-G填充/钝针的细胞团块。轻轻吸取的溶液来回使用注射器10倍。 离心机暂停5分钟，在500 XG，4℃。弃去上清液。 用预冷的枪头，重悬在基底膜基质细胞沉淀。 申请50微升隐窝悬浮液以每孔基底膜基质上的预热板。慢慢喷射在井的中心基底膜基质。 将24孔板在37℃，5％CO 2的培养箱中20分钟，以使基底膜基质的完全聚合。 覆盖基底膜基质用500微升完整的人类minigut介质辅以10μMY-27632（1：1000稀释10毫米股票）。 孵育所述板在37℃，5％CO 2的培养箱中培养。 术后第2天（：1000稀释10毫米的股票1），更换新鲜完整的人类minigut培养基中添加10μMY-27632的培养基中。此后，用新鲜的，完整的人类minigut中更换培养基隔日1次。 6.冷冻培养Enteroids和Colonoids的注：通常冻结一口井成2-3冷冻管。 重复步骤5.1至5.8。 悬浮用冷冻介质中的颗粒。转移1毫升冷冻液到标记离心管中。将离心管中含有500毫升异丙醇的冷冻集装箱。 在冷冻集装箱转移到80℃的冷冻24小时，然后转移到离心管液氮储存。 注：存储Enteroids和Colonoids长达1年。