배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수
Summary
The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson’s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.
Abstract
Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson’s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.
Introduction
흑질에서 도파민 신경 세포의 손실 compacta는 파킨슨 병 (PD), 두 번째 가장 흔한 신경 퇴행성 질환의 추기경 모터 증상에 이르게 갈 거예요. 이 중뇌 신경 인구의 서거의 근본적인 원인은 알려져 있지 않다. 사용 된 개발 및 신경 생리 학적 특성과 mesDA 신경 세포, 여러 세포 배양 및 동물 모델 시스템의 생존을 변조에 대한 책임을 생화학 적 경로를 연구합니다. 쥐의 도파민 세포주 1RB 3 27 (N27), 인간 도파민 신경 아세포종 세포주 SH-SY5Y, MN9D 인간 중뇌 세포를 LUHMES 마우스 도파민 하이브리드 세포주 포함 불멸화 세포주는, 생화학 및 제한된 역학적 연구 한 사용되어왔다 -5. mesDA 뉴런 특이 손실 연구를 위해 몇몇 신경 독소 계 유전 모델 6-8 개발되었다. 차 복부 중뇌 문화, 도파민 성 신경 세포의 신경 세포와 시냅스 특성이 일반적인 장애의 발병 기전에 관여하는 경로를 연구하기위한 필수 불가결 한 도구를 제공합니다.
여기에서 우리는 더 높은 생존 성 및 배아 당 된 커버의 수율 증가의 결과로 수정을 포함 중뇌 도파민 신경 세포의 분리에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 사전 성숙한 E12.5 마우스 중뇌 (쥐에 E14.5)의 사용은 생존을 향상시킵니다. 이 나이에 신경 해부 동안 그대로 세포 잎, 이는 아직 축삭을 개발하여 현저하게 수명을 연장해 스트레스를 최소화하지 않았습니다. 또한,이 프로토콜의 2 절에 설명 된대로 복부 중뇌의주의 해부, 더 생존 성을 향상시킨다. 커버 슬립 당 배아의 개수를 증가시키기 위해 대안적인 도금법이 프로토콜 부 (4)에 제시되어있다. 이 아래 4 된 커버에 비해 배아 당 최대 10 된 커버의 수율로 연결표준 도금 조건 따라서 당 실험 동물의 양을 감소시킨다.
축삭과 dentrites의 문화 전시 가지 뉴런은 시냅스 연결을 형성 라이브 세포 이미징, 면역 세포 화학 및 전기 생리학 연구에 대한 이러한 문화가 적합 신경 세포와 시냅스 마커의 존재를 알 수있다. 또한, 신경 세포 배양의 사용은 유전 적 및 약리학 적 조작을 용이하게한다. 체외에서 2 일에서 신경 돌기의 가지 발달 연구 수 있습니다. 또한, 문화의 장기 생존율 (최대 6 주) 뉴런의 느린, 진보적 인 변성의 연구에 적합합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
중뇌 도파민 성 신경 세포는 중추 신경계에서 도파민의 주요 원인이다. 그들은 세 그룹으로 나누어, 흑질의 유리체 compacta (SNpc), 복부 피개 영역 (VTA)과 retrorubral 필드 (RRF) 10, 11. SNpc과 VTA의 뉴런은 감정, 동기 부여 및 모터 동작의 제어 등의 기능에 관여, mesocortical 변연계 및 nigro – 선조체 주요 도파민 경로, 상승을 제공합니다. SNpc 흑질 선조 및 시스템의 기능적 파괴에서 뉴런의 죽음은 제 ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was performed using the Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London startup funds to K.N.A.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 24020-117) | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048) | |
| D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water | Sigma | G8769 | |
| Bovine serum albumin BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsin (0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested | Sigma | A9418 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% solution | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 antibody | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Blade Holder/Breaker Flat Grip – 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Student Iris Scissors – Straight 11.5cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Fiber optic halogen illuminator | Nikon | MKII | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hemocytometer | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 µm sterile filter units | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20mm Petri dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
Referenzen
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