בידוד, תרבות והטווח ארוך תחזוקה של יסודיים mesencephalic דופאמין נוירונים ממוח עוברי מכרסם
Summary
The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson’s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.
Abstract
Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson’s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.
Introduction
הפסד של נוירונים דופאמין מnigra substantia pars compacta מוביל לתסמינים מוטוריים העיקרי של מחלת פרקינסון (PD), ההפרעה ניוונית של מערכת עצבים הנפוצה ביותר השנייה. הסיבה הבסיסית של פטירתו של אוכלוסייה העצבית mesencephalic זה אינה ידועה. כדי לחקור את התהליכים הביוכימיים אחראים על הפיתוח וויסות נכסים והישרדות של תאי עצב mesDA, כמה תרבית תאים ומערכות מודל החיה neurophysiological היה בשימוש. שורות תאים הנציחו, כולל 1RB דופאמין עכברוש קו תא 3 27 (N27), שורת תאי נוירובלסטומה דופאמין אדם SH-SY5Y, שורת התאים היברידיים דופאמין העכבר MN9D וmesencephalic אדם LUHMES תאים היו בשימוש במשך מחקרים מכניסטית ביוכימיים ומוגבלים 1 -5. לצורך המחקר של האובדן הספציפי של נוירונים mesDA, כמה עצבים מבוססי ומודלים גנטיים פותחו 6-8. תרבויות המוח התיכון הגחון ראשיות, מספק כלי הכרחי ללימוד התכונות עצביות והסינפטי של נוירונים דופאמין והמסלולים מעורבים בפתוגנזה של הפרעה שכיחה זו.
כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד של נוירונים דופאמין mesencephalic, המכיל שינויים וכתוצאה מכך שרידות גבוהות יותר ותשואה מוגברת של coverslips לעובר. שימוש בmesencephalon טרום בוגרים עכבר E12.5 (E14.5 בחולדה) משפר שרידות. בגיל זה הנוירונים לא פיתחו האקסונים עדיין, מה שמשאיר תאים שלמים במהלך נתיחה וממזער את הלחץ ובכך להגדיל באופן משמעותי את הכדאיות. בנוסף, לנתיחה זהירה של המוח התיכון הגחון, כפי שתוארו בסעיף 2 לפרוטוקול זה, משפרת עוד יותר את השרידות. כדי להגדיל את המספרים של coverslips לעובר, שיטת ציפוי חלופית מוצגת בסעיף 4 לפרוטוקול זה. זה מוביל לתשואה של עד 10 coverslips לכל עובר לעומת 4 coverslips תחתתנאי ציפוי סטנדרטיים ובכך להקטין את כמות בעלי חיים לכל ניסוי.
הנוירונים בתולדת תערוכת תרבות של אקסונים וdentrites, יוצרים קשרים סינפטיים ולחשוף את הנוכחות של סמנים עצביים והסינפטי עושים תרבויות אלה מתאימים להדמיה לחיות תא, immunocytochemical ומחקרי אלקטרו. יתר על כן, השימוש בתרבויות עצביות מאפשרת מניפולציה גנטית ותרופתית. תולדה של neurites מיום 2 במבחנה מאפשרת למחקרים התפתחותיים. יתר על כן, ההישרדות לטווח הארוך של תרבויות (עד שישה שבועות) הופכת אותם מתאימה למחקר של הניוון האיטי, ההדרגתי של תאי העצב האלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
נוירונים דופאמין במוח תיכון הם המקור העיקרי של דופמין במערכת העצבים המרכזית. הם חולקו לשלוש קבוצות, compacta סעיפי nigra substantia (SNpc), אזור הגחון tegmental (VTA) ושדה retrorubral (RRF) 10, 11. הנוירונים בSNpc וVTA להצמיח מסלולים עיקריים דופאמין, mesocortical, mesolimbic וNigro-striatal, מעורבים בפונקציות כגון…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was performed using the Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London startup funds to K.N.A.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 24020-117) | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048) | |
| D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water | Sigma | G8769 | |
| Bovine serum albumin BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsin (0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested | Sigma | A9418 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% solution | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 antibody | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Blade Holder/Breaker Flat Grip – 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Student Iris Scissors – Straight 11.5cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Fiber optic halogen illuminator | Nikon | MKII | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hemocytometer | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 µm sterile filter units | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20mm Petri dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
Referenzen
- Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
- Fall, C. P., Bennett, J. P. Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).
- Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).
- Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression. Neural Dev. 4, 11 (2009).
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain. 133, 2022-2031 (2010).
- Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson’s disease. Bioessays. 24, 308-318 (2002).
- Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson’s disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).
- Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson’s disease in mice. Lancet neurology. 10, 1108-1118 (2011).
- Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation. J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).
- Sgado, P., et al. Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice. PNAS. 103, 15242-15247 (2006).
- Alavian, K. N., et al. The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed. J Biomed Sci. 21, 27 (2014).
- Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors. Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson’s disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).
- Schapira, A. H. Aetiopathogenesis of Parkinson’s disease. J Neurology. 258, S307-S310 (2011).
- Chung, C. Y., et al. Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection. Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).
