Isolement, Culture et maintenance à long terme des mésencéphalique primaire dopaminergiques neurones à partir de cerveaux embryonnaires de rongeurs

La perte de neurones dopaminergiques de la substantia nigra pars compacta conduit à des symptômes moteurs cardinal de la maladie de Parkinson (MP), le deuxième trouble neurodégénératif le plus répandu. La cause sous-jacente de la disparition de cette population neuronale mésencéphalique ne est pas connu. Pour étudier les voies biochimiques responsables du développement et de moduler les propriétés neurophysiologiques et la survie des neurones MESDA, plusieurs culture cellulaire et des systèmes de modèles animaux ont été utilisés. Les lignées cellulaires immortalisées, y compris la dopaminergique chez le rat lignée cellulaire 1RB ₃ AN ₂₇ (N27), le dopaminergique humain lignée cellulaire de neuroblastome SH-SY5Y, la lignée cellulaire hybride dopaminergique de la souris MN9D et mésencéphalique humaine LUHMES cellules ont été utilisées pour des études mécanistiques biochimiques et limitées ^{1 -5.} Pour l'étude de la perte spécifique de neurones MESDA, plusieurs neurotoxine-fondées et les modèles génétiques ont été développés ^6-8. Cultures mésencéphale ventrales primaires, Fournir un outil indispensable pour étudier les propriétés neuronales et synaptiques des neurones dopaminergiques et les voies impliquées dans la pathogenèse de cette maladie fréquente.

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour l'isolement des neurones dopaminergiques mésencéphaliques, qui contient des modifications résultant en la capacité de survie plus élevé et un rendement accru de lamelles par embryon. L'utilisation de la souris E12.5 mésencéphale pré-mature (E14.5 chez le rat) améliore la survie. À cet âge neurones ne ont pas encore développé axones, ce qui laisse des cellules intactes lors de la dissection et minimise la contrainte augmentant ainsi considérablement la viabilité. En outre, dissection minutieuse du mésencéphale ventral, tel que décrit dans l'article 2 de ce protocole, améliore encore la capacité de survie. Pour augmenter le nombre de lamelles par embryon, une méthode de placage de remplacement est présenté dans la section 4 de ce protocole. Cela conduit à un rendement allant jusqu'à 10 lamelles par embryon par rapport aux lamelles de moins de 4conditions de placage classiques réduisant ainsi la quantité d'animaux par expérience.

Neurones en culture exposition excroissance des axones et des dendrites, forment des connexions synaptiques et révèlent la présence de marqueurs neuronaux et synaptiques faisant ces cultures appropriée pour l'imagerie de cellules vivantes, immunocytochimique et des études électrophysiologiques. En outre, l'utilisation de cultures de neurones facilite la manipulation génétique et pharmacologique. Excroissance de neurites de deux jours in vitro permet d'études sur le développement. En outre, la survie à long terme des cultures (jusqu'à six semaines) les rend appropriés pour l'étude de la lente, de la dégénérescence progressive de ces neurones.