The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.
A estimulação cerebral profunda (DBS) cirurgia, tendo como alvo várias regiões do cérebro, como os gânglios basais, tálamo e regiões subtalâmico, é um tratamento eficaz para vários distúrbios de movimento que não conseguiram responder à medicação. Os progressos recentes no campo da cirurgia DBS começou a alargar a aplicação desta técnica cirúrgica para outras condições tão diversas como obesidade mórbida, depressão e transtorno obsessivo compulsivo. Apesar dessas indicações em expansão, pouco se sabe sobre os mecanismos fisiológicos subjacentes que facilitam os efeitos benéficos da cirurgia DBS. Uma abordagem a esta questão é a realização de análise de expressão gênica em neurônios que recebem a estimulação elétrica. Estudos anteriores demonstraram que a neurogénese no giro dentado de ratos é induzida em DBS segmentação do núcleo anterior do tálamo 1. Cirurgia DBS visando a ATN é amplamente utilizado para o tratamento da epilepsia refratária. É, portanto, de muito interest para nós para explorar as mudanças de transcrição induzidos ao estimular eletricamente o ATN. Neste artigo, são apresentadas as nossas metodologias para estereotaxicamente-guiada cirurgia DBS visando a ATN em ratos Wistar machos adultos. Discutimos também as etapas subseqüentes para dissecção dos tecidos, o isolamento do RNA, a preparação de cDNA e RT-PCR quantitativo para medir as mudanças de expressão gênica. Este método pode ser aplicado e modificado para estimular os gânglios da base e em outras regiões do cérebro normalmente clinicamente alvo. O estudo de expressão gênica descrito aqui assume uma abordagem gene alvo candidato para descobrir jogadores moleculares que poderiam ser direcionando o mecanismo para DBS.
A história por trás do desenvolvimento de estimulação profunda do cérebro como uma técnica neurocirúrgica remonta à década de 1870, quando a possibilidade de estimular eletricamente o circuito cerebral foi explorada 2. O uso da estimulação de alta frequência crônica como tratamento para distúrbios neuronais começou na década de 1960 3. Mais tarde, na década de 1990, com o advento de eléctrodos de implantação crónica de DBS 4-6, o número de distúrbios neuronais que foram tratados por DBS continuou a aumentar. A estimulação cerebral profunda foi usado pela primeira vez nos Estados Unidos como um tratamento para o tremor essencial 6. Hoje, a cirurgia é amplamente utilizado para tratar desordens neuronais que estão actualmente tratável por intervenção farmacológica. DBS é actualmente utilizado para o tratamento de perturbações do movimento da doença de Parkinson e distonia 7-9. Demência de tipo Alzheimer, doença, epilepsia, dor e doenças neuropsiquiátricas tal depressão de Huntington, OCD, Tourette7; s síndrome e vício são algumas das condições passíveis de tratamento por DBS 10-12. Enquanto a cirurgia DBS é aprovado pela FDA para o tratamento da doença de Parkinson, a distonia e tremor essencial, a utilização de DBS para o tratamento de outras condições mencionadas acima estão em vários estágios de laboratório e estudos clínicos que oferecem a promessa muito doentes 13,14.
Clinicamente, a cirurgia de DBS é realizada em duas fases. A primeira etapa envolve a posicionar os eléctrodos cirurgicamente DBS na localização anatómica alvejado usando uma combinação de posicionamento radiológico, CT, MRI, bem como leituras microeléctrodos para maior precisão. A segunda fase envolve a implantação de um gerador de impulsos no peito do paciente e a instalação de extensões do couro cabeludo para o gerador de impulsos. Com base na condição neurológica, vários esquemas de programação para o gerador de impulsos foram padronizados e irá ser utilizado para entregar a tensão desejada. A final, voltagem é atingida de forma gradual, de modo a receber a melhor resposta clínica com o mínimo de tensão 15. No entanto, nos nossos estudos, ao contrário dos implantes DBS crónicas utilizado clinicamente, por uma questão de simplicidade, que recorreram a estudar um tempo de estimulação de alta frequência (durante 1 hora) nos modelos animais.
Parte da pesquisa do nosso grupo concentra-se em investigar o uso da cirurgia DBS para a epilepsia refratária ao tratamento. Abordagens cirúrgicas estereotáxica, com auxílio de estimulação de alta frequência tem sido explorado por muitos outros como uma opção eficaz para tratar a epilepsia clinicamente refratária, que constitui cerca de 30% de todas as incidências de epilepsia 10,16,17. Estimulação cerebelar direccionamento da superfície cortical bem como os núcleos profundos do cerebelo têm sido utilizados no passado como alvos para o tratamento de epilepsia 10,18,19. Além disso, a estimulação hipocampo também foi tentado, mas com resultados mistos 20,21. Alguns dos outros investigadaMetas DBS para a epilepsia incluem o córtex cerebral, tálamo, núcleo subtalâmico e nervo vago 8. No entanto, após os resultados de vários estudos nos últimos anos, o núcleo talâmico anterior (ATN) emergiu como o alvo mais comum DBS para o tratamento da epilepsia 10,22. Com base nos conhecimentos sobre circuitos neuroanatomical e resultados de modelos animais, vários estudos têm-se centrado sobre o efeito terapêutico de estimulação cerebral profunda da ATN no tratamento de epilepsia 23-26. A ATN é parte do circuito límbico e está localizado na região do cérebro que afeta a frequência de crises. Estudos por Hamani et al., Testaram a eficácia da NTA-DBS em um modelo de epilepsia induzida por pilocarpina e descobriu que a estimulação bilateral ATN latências para convulsões induzidas por pilocarpina e estado de mal epiléptico 24 prolongada. Além disso, a alta estimulação da ATN frequência foi encontrada para reduzir a freqüência de crises em um modelo de pentilenotetrazol (PTZ) de epilepsy 25,27-29. Lee et al., Relataram uma redução média da frequência de crises por cerca de 75% em cima da estimulação cerebral profunda crônica da ATN no tratamento da epilepsia refratária parcial 30.
Um recente estudo clínico sobre a epilepsia refratária ao tratamento tem mostrado resultados promissores após a cirurgia DBS visando o núcleo talâmico anterior (ATN) 22. Um ensaio clínico multicêntrico, randomizado, com 110 pacientes submetidos a DBS bilateral da ATN para o tratamento de epilepsia refratária (trial SANTE) indicaram uma queda na frequência de crises por cerca de 40% 31. Os resultados deste estudo também sugeriu em um efeito anti-epiléptico ideal atrasado observado em 2-3 meses após a cirurgia. Estudos adicionais por Toda et al., Corroborado com estes resultados, onde eles demonstraram neurogênese acontecendo em um momento pós tarde DBS (dias 3-5) em modelos animais 1. Além disso, Encinas et al., Relataram neurogène hipocamposis no giro denteado do rato adulto, após a estimulação da ATN 32 de alta freqüência. Estudos anteriores 33-35 relataram declínio neurogênese em certos casos de epilepsia, como a epilepsia crônica do lobo temporal e uma associação com déficits de aprendizagem, perda de memória e espontâneas convulsões motoras recorrentes. Além disso, houve uma redução nos factores de células estaminais progenitoras neurais, tais como o FGF2 e de IGF-1 no hipocampo cronicamente epiléptico em modelos animais 33. Considerando isso, estratégias de intervenção, tais como DBS que mostram um aumento da neurogênese no giro dentado são caminhos interessantes para a pesquisa. Estes resultados têm nos encorajado a explorar mais profundamente o mecanismo subjacente tratamento neurogênese pós-DBS para a epilepsia. Temos como alvo a ATN tanto unilateral (dados não publicados), bem como a nível bilateral (em resultados representativos) e neurotrofina elevado visto (BDNF) expressão no giro dentado de ratos. Nosso current hipótese é que a expressão de BDNF inicia uma cascata de expressão do gene que culmina na neurogénese que traduz o efeito anti-epiléptico de cirurgia de DBS. Neste artigo, apresentamos os nossos métodos de cirurgia DBS visando a ATN em ratos, seguido de análise de expressão gênica como uma abordagem atraente para estudar o mecanismo subjacente aos benefícios do DBS.
Após o trabalho de Marco por Benabid et al. Em usar estimulação cerebral profunda para tratar a doença de Parkinson e tremor essencial, a técnica cirúrgica DBS foi investigado com muito interesse ao longo da última década para tratar vários distúrbios neurológicos 6,10,43. DBS estudos que visam várias regiões neuro-anatômica dos circuitos cerebrais são atualmente realizados por vários grupos para abordar as principais doenças neuronais e estão em várias fases de ensaios clínicos. …
The authors have nothing to disclose.
We are grateful for the support of the NREF foundation.
Deep Brain Stimulation Surgery | |||
Reagent/Equipment | Vendor Name | Catalog No. | Comments |
Stereotactic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
Drill | Dremmel | 7700, 7.2 V | |
Scalpel | BD | 372610 | |
Ketamine | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules |
Xylazine | Patterson Veterinary | 07-808-1947 | |
Buprenorphine | Patterson Veterinary | 07-850-2280 | Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules |
Surgical staples | ConMed Corporation | 8035 | |
Sutures (3-0) | Harvard Apparatus | 72-3333 | |
Syringe (1 ml, 29 1/2 G) | BD | 329464 | Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally |
Syringe (3 ml, 25 G) | BD | 309570 | Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously |
Needles | BD | 305761 | Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes |
Ethanol | Fisher Scientific | S25309B | Use for general sterilization |
Eye Lubricant | Fisher Scientific | 19-898-350 | |
Stimulator | Medtronic | Model 3628 | |
DBS electrodes | Rhodes Medical Instruments, CA | SNEX100x-100mm | Electrodes are platinum, concentric and bipolar |
Betadine (Povidone-Iodine) | PDI | S23125 | Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision |
Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation | |||
Reagent/Equipment | Vendor Name | Catalog No. | Comments |
Acrylic Rodent Brain Matrix | Electron Microscopy Sciences | 175-300 | www.emsdiasum.com |
Razor Blade | V W R | 55411-050 | |
Guillotine Scissors | Clauss | 18039 | For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition |
Scissors | Codman Classic | 34-4098 | Use for removing the brain from the skull |
Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72957-06 | Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection |
Phosphate Buffered Saline | Boston Bioproducts | BM-220 | |
RNA Extraction and cDNA Preparation | |||
Reagent/Equipment | Vendor Name | Catalog No. | Comments |
Tri Reagent | Sigma | T9424 | Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin |
Syringe (3 ml, 25 G) | BD | 309570 | Use for tissue homogenization |
Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin |
Isopropanol | Fisher Scientific | A416-1 | |
Glycogen | Thermo Scientific | R0561 | |
Dnase I Kit | Ambion | AM1906 | |
Superscript First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 11904-018 | |
Tabletop Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
Quantitative PCR | |||
Reagent/Equipment | Vendor Name | Catalog No. | Comments |
SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204143 | |
Custom Oligos | Invitrogen | 10668051 | |
PCR Plates (96 wells) | Denville Scientific | C18080-10 | |
Optical Adhesive Sheets | Thermo Scientific | AB1170 | |
Nuclease free Water | Thermo Scientific | SH30538-02 | |
Real Time PCR Machine | Applied Biosystems | 7500 |