卵巣がんの腫瘍開始細胞の体外富化

卵巣癌細胞株の1伝統文化（接着条件） 注：細胞および培地の全ての処理は、無菌の組織培養フード内で行われるべきである従来の細胞培養培地を準備します。 1 DMEM：1使用F12（+ L-グルタミン+ 15mMのHEPES）を、10％熱不活化ウシ胎児血清および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補足する。 0.45μmの真空フィルターを使用してフィルタソリューション。 名前、日付、およびinterest.Removeの細胞株超低冷凍庫または液体窒素からの細胞のバイアルの継代数で標識された伝統的なポリスチレン75センチメートル2組織培養フラスコを準備します。 5分間37℃の水浴中に置くことによって、除霜。 3ミリリットルの伝統的な細胞培養培地（上記で調製）を含む15ml遠心管にバイアルから転送サスペンション。 400×gで5分間4℃で遠心サスペンション。一方、フラスコに16ミリリットルの伝統的な細胞培養培地を加える。 上清を吸引。フラスコにペレットと転写懸濁液を緩め上下2ミリリットル、伝統的な細胞培養培地をピペット細胞を使用して。穏やかにロックフラスコに均等に37℃、5％CO 2に設定した加湿細胞培養インキュベーター中cells.Placeフラスコを配布する。 80％のコンフルエンスに達するまで、毎日の細胞を監視します。 2細胞培養フード内：細胞は一旦80％コンフルエント培養物1を分割する。上清を吸引し（カルシウムおよびマグネシウムを含まない）、温かいリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄する。 1.5ミリリットルトリプシン0.25％-EDTAを追加し、室温で3〜5分間インキュベートする。 2新しいポリスチレン75センチメートル2フラスコを準備し、各フラスコに16ミリリットルの伝統的な細胞培養培地を追加。新しいフラスコのそれぞれに4ミリリットル従来の細胞培養培地と等量のアリコートでトリプシン処理した細胞を再懸濁する。 加湿細胞培養インキュベーター内の場所フラスコを37℃、5％CO 2に設定する。 80％のコンフルエンスに達するまで、毎日の細胞を監視します。細胞を分割し続け、-80または液体窒素中で文化や凍結して保存。 フローティングまたは接着細胞を用いた卵巣癌細胞株から多細胞スフェロイドの2世代注：細胞および培地の全ての処理は、無菌の組織培養フード内で行われるべきである。 2のための伝統的な培養法の下で細胞株を培養した後 – 3継代（セクション1）は、次の手順に進みます。 幹細胞のメディアを準備します。 1 DMEM：F12（+ L-グルタミン+ 15mMのHEPES）と、1％のノックアウト血清代替物（100 U / mlの最終濃度のペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン）、1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補足1を使用0.4％ウシ血清アルブミン、および0.1％のインスリン – トランスフェリン – セレニウム。 0.45μmの真空フィルターを使用してフィルタソリューション。 20ng / mlのと10のn最終濃度のヒト組換え上皮成長因子（EGF）およびヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（FGF）と補足幹細胞培地G / mlで、それぞれ。 NOTE：成長因子は、使用直前に、幹細胞培地を新鮮な添加すべきである。 フローターTIC文化を作成します。伝統的な接着性の培養条件で成長させた80％のコンフルエント細胞のフラスコを削除します。背後に付着した人口を残して、メディア、すべての浮遊細胞（単一および凝集）を収集し、50ミリリットルのポリプロピレン遠心管に移す。 400×gで5分間4℃で遠心サスペンション。 注：浮遊細胞および凝集体は明らかである24から72時間後に付着細胞が伝統文化の下でフラスコに取り付けされた後。約1.0〜80％コンフルエントのプレートから検索- 5.0×10 5生存浮遊細胞は、細胞株に依存して、期待することができる。 TGS-ための5×10 5.0 5 ACI-23のために、4.8×10 5 OVCAR5ために、3.5×10 5 CAOV3ための、および1.0×10：この研究では、80％のコンフルエント接着培養から収集した浮遊細胞の平均数であった3。転送の際に、マルチセル伝統的でウラルスフェロイド形成とTIC文化をフローター、これはやや依存性細胞株であるが、数日以内に発生します。例えば、ACI-23細胞は、より容易にCAOV3細胞よりも凝集体を形成する。 一方、名前、日付、および細胞株の継代数で標識された超低取付面ポリスチレン75cm 2の組織培養フラスコを調製する。フラスコに成長因子を添加した細胞メディア幹ミリリットル10を追加します。 遠心分離が完了したら、6を追加することによって、低付着フラスコに培地を吸引し、転送ペレットを細胞培地とピペットアップ幹ミリリットルダウンペレットを緩める。加湿細胞培養インキュベーター内の場所フラスコを37℃、5％CO 2に設定する。回転楕円体の形成を観察するために3日間 – ごとに2細胞を監視します。 伝統的なTIC文化を作成します。伝統的な接着性の培養条件で成長させた80％のコンフルエント細胞のフラスコを削除します。吸引し、メディアと温かいPBSで洗浄する。 1.5ミリリットルトリプシン0.25％EDTAを加え、インキュベート3から5RTで分。 名前、日付、および細胞株の継代数で標識された超低接着表面ポリスチレン75cm 2の組織培養フラスコを調製する。フラスコに、説明したように、EGFおよびFGFを補充した細胞培地を、ステム10ミリリットルを加える。 トリプシンでフラスコに細胞媒体幹ミリリットル6を追加します。上下にピペット細胞溶液とフラスコ表面から細胞を緩めしよう。 10を含有する超低付着フラスコに細胞のボリューム全体を転送する細胞培地幹ミリリットル。加湿細胞培養インキュベーター内の場所フラスコを37℃、5％CO 2に設定する。 それぞれ、ミリリットル/ 20ng / mlのおよび10ngの最終濃度のための細胞培地と新鮮なEGFとFGF幹mlの追加の2で72時間 – TICの文化ごとに48を補足する。 80％のコンフルエンスに達した – 60までのセルを監視します。 2新しい超低付着フラスコに等しい体積を配置し、18 mlの最終容積を達成するために、新鮮な幹細胞培地を添加することにより、分割培養。代替案LY、400×gで5分間4℃で遠心全体サスペンション。幹細胞培地中で細胞を再懸濁は、EGFとFGFを補充し、新しい超低付着フラスコに均等に分配する。細胞は、継代のために、単一細胞懸濁液に解離される必要はない。 注：この時点で培養を分割し、培養し、凍結、または実験的に解析するために操作し続けることができる。フローターTIC培養のための伝統的な接着性、伝統TICのために4.0×10 6 8.0×10 6、および5.0×10 6：80％の細胞の以下の濃度は、ACI-23のために検索された合流- 60。 10日、と再び減少 – CD133 + ALDH +細胞の割合は、最初の3日以内に5位のピークは低いとしてTIC濃縮に最適な培養液中で10日間 – それは細胞株に依存するかもしれませんが、私たちは5ことを見出した14日。 初代上皮卵巣癌細胞株および多スフェロイドの3世代化学療法抵抗性患者の腹水から注：治験審査委員会の承認が、このプロトコルが得られた。細胞および培地の全ての取扱いは無菌の組織培養フード内で行われるべきである。 従来の細胞培養培地との1：1液体プレート腹水。セクション1で説明したようにメディアを準備し、いくつかの伝統的なポリスチレン75cm 2の組織培養フラスコに10ミリリットルを追加します。 腹水は、通常は1 Lの滅菌真空ボトルで提供されている。真空キャップを外す。慎重に37℃、5％CO 2に設定した加湿細胞培養インキュベーター中で10ミリリットル従来のメディアと場所を含むフラスコする流体を10mlの腹水を追加する。完全なメディアの変更を行う前に、96時間 – 72静かにしておきます。 80％のコンフルエンス – 細胞が60に達するまで3日間 – すべての2メディアを変更項1. TIC培養で説明したようにセクション2で説明したように2： – 細胞が60に達すると、80％コンフルエントに、1分割。 注：ascitに存在する赤血球それらは非接着性であるようにesが最初の培地交換の後に除去される。存在するいずれの線​​維芽細胞は、主に、彼らはより敏感であり、トリプシンに最小限の露出で持ち上げるようにトリプシンで処理した後に削除されます。卵巣癌細胞の純度は、CA-125（MUC16）に対する抗体を用いたフローサイトメトリー分析により決定した。 TICマーカーのフローサイトメトリ確認のための細胞の4染色 TICの文化を収集します。を50mlのポリプロピレン遠心管にフラスコの内容物を移す。 400×gで5分間遠心懸濁液。吸引し、メディアと温かいPBSで洗浄する。 2mlのに非酵素的細胞解離溶液を加えインキュベート3 – 37°Cで5分間、そしてピペッティング上下塊を破壊し、単細胞に解離する。細胞媒体幹ミリリットル4を追加します。 接着培養を収集します。吸引し、メディアと温かいPBSで洗浄する。 3ミリリットルの非酵素的細胞解離溶液を加え、インキュベート3 – 37°Cで5分間。従来のセル3ミリリットルを追加します。培養培地およびフラスコから細胞を剥離し、遠心管に収集するために繰り返して上下にピペッティング。 遠心TIC 400×gで5分間付着懸濁液両方。上清を捨て、3％のウシ胎児血清を含む1mlのPBSで各ペレットを再懸濁。 RTで30分インキュベートする。一方、トリパンブルーを用いて生存細胞の数を数える。スフェロイドは、単一の細胞に分離されている確認するために、顕微鏡で細胞を観察します。 以下の培養条件のそれぞれのラベル5×1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブ：1）未染色（補正用の非染色対照）、2）ALDH（補償のための単一の染色陽性対照）、3）、CD133（補償のための単一の染色陽性対照）、4 ）ALDH + CD133（実験試験サンプル）、および5）DEAB + ALDH（FL-1、FL-4チャンネルにおけるバックグラウンド蛍光のためのネガティブコントロール、それぞれ）。 400×gで5分間4.遠心懸濁液-チューブに約5×10 5細胞それぞれの＃1を配布します。吸引しsupernata500μlのALDEFLUORアッセイバッファーでNTおよび再懸濁ペレット。実験的な負の制御のためのチューブ＃5に10μlのDEAB（ALDH阻害剤）を追加します。 補償ミックスするポジティブコントロールとフリックのためのチューブ＃2にALDEFLUOR試薬を活性化した5μlを添加する。実験的な分析のためのチューブ＃4にALDEFLUOR試薬を活性化した5μlを添加する。フリック管が混在し、すぐにDEABが含まれているチューブ＃5（250μL）にチューブ＃4からの細胞の半分のボリュームを転送します。 フリックチューブはよく混合する。光から保護し、37℃で45分間 – 30すべてのチューブをインキュベートします。細胞が底に沈むようフリック管は、潜伏期間の途中で。 400×gで5分間遠心操作は、すべてのチューブ。 500μlのALDEFLUORアッセイ緩​​衝で吸引し上清および再懸濁細胞。 CD133染色でチューブ用（＃3、＃4）、直接ALDEFLUORアッセイバッファーにCD133-APC 1時11分を追加します。光から保護氷上で15分間インキュベートします。 400×gで5分間遠心CD133管。 1回洗浄アッセイ緩​​衝ALDEFLUOR 500μL。それぞれ500μlのALDEFLUORアッセイバッファー、で細胞を再懸濁。 セルストレーナーキャップを有する個々のポリスチレン丸底チューブにフィルタ懸濁液。ボリューム全体がキャップを介して濾過されていることを確認。 細胞集団を分析するためにフローサイトメーターを使用する。補償制御を設定するためのチューブを＃1-3を使用してください。フォワードの使用及び側方散乱パラメータ、ゲート細胞、細胞破片を除外するようにしてくださいという。それぞれ、ALDH +およびCD133 +ダブルFL-1を用いて細胞およびFL-4チャネルを確立します。 フローサイトメトリー分析プログラムを用いて、培養条件は、これらの二つのマーカーのためのより高い染色を有するべきであるTIC富む培養物TIC細胞の割合を高め確認する。 NOTE：CD133およびALDHに加えて、他のmarkersof卵巣癌のTICは、フローサイトメーターの能力に依存するいずれかのサンプルで使用されるマーカーの数を分析することができる。 5. インビボ </eM>皮下注射細胞集団の腫瘍形成性を確認するために、 注：治験審査委員会の承認が、このプロトコルが得られた。 3のケージでの実験群に8週齢と注射前に数日間順応できるようにする – 6胸腺欠損雌ヌードマウスを配布します。 NIH動物実験委員会に従って人道的な実験的なガイドラインの下でマウスに従ってください。体重、体重減少などの物理的な外観を監視したり、20％を超える、衰弱外観、下痢または皮膚炎を得て、CO 2窒息によってこれらの基準を当てはめたマウスを安楽死させる。 1mlのPBSに再懸濁部2の各細胞集団に記載のように培養物を収集する。パンブルーアッセイを用いて生細胞を数える。 15ミリリットル遠心管を準備します。三重の対策について（0.5ミリリットルの容量で5×10 5個の細胞を皮下右Fに注入され、各チューブに2mlのPBSで希釈した1.5×10 6生細胞を追加各マウスの痩せ細った）。唯一の対照マウスのために0.5mlのPBSを準備します。 27 G針を使用して、群あたり3匹のマウスのそれぞれの右脇腹にTIC培養フロータ、またはPBS、従来の付着培養、従来のTIC培養から0.5ミリリットルの細胞懸濁液をsubcutaneouslyinject。オリジナルのケージ、注射後にマウスを返します。 マウスを秤量し、ノギスweeklyby回二次元で任意の触知可能な腫瘍を測定し、長さと幅を設定する。 注： – 細胞株に応じて50日腫瘍待ち時間通常20である。 標準的な方法（V =（幅）2×長さ/ 2）による腫瘍湿潤体積を計算します。 注：この研究は、最初の世代のために、接着性細胞対のTICの腫瘍形成を比較したが、同様の条件下で成長したのTIC のin vivoでの連続継代は他人11,20によって完成されたものである。