JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medizin

In vitro Verrijking van eierstokkanker tumor-initiërende cellen

Published: February 18, 2015
doi:
10.3791/52446
, ,
1Women’s Malignancies Branch,National Cancer Institute

Summary

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

Abstract

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent ‘floater’ cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

Introduction

Eierstokkanker is de meest dodelijke gynaecologische maligniteit in de Verenigde Staten met de belangrijkste oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wordt de zeer terugkerende, chemoresistent gebruik van deze ziekte. Primaire behandeling bestaat meestal maximale cytoreductieve chirurgie en de daaropvolgende platina gebaseerde therapie, hoewel er enige aanwijzingen neoadjuvante therapie nuttig zijn in sommige gevallen 1 zou kunnen zijn. De meerderheid van de patiënten reageren positief op de primaire behandeling, maar helaas helft zal recidief binnen 18 maanden 2.

De meeste ovariële maligniteiten zijn epitheliale carcinomen en kunnen afkomstig zijn uit het oppervlak epitheel van de eierstok of eileider 3,4. Verschillende studies ondersteunen het bestaan ​​van somatische stamcellen in het vrouwelijk voortplantingssysteem dat vermoedelijk helpen bij weefselherstel die nodig is na ovulatie 5,6. De hoge proliferatie activiteit op zowel de eierstok en eileider tijdens ovultie kan een belangrijke factor in de ontwikkeling van eierstokkanker (Gharwan, et al. manuscript ingediend). De afleiding van tumor-vormende cellen is onduidelijk, maar ze kunnen het gevolg zijn van normale stamcellen, stamcellen, of gedifferentieerde cellen door mutaties die ze niet in staat om verdeeldheid of het lot te reguleren maken. Deze cellen zijn ook genoemd "kanker stamcellen" of "kanker initiërende cellen" en kunnen groeien in tumorigene, multicellulaire sferoïden bij weinig beslag. Hoewel het hiërarchisch model van TIC ontwikkeling dynamisch kan zijn, hoeft TICs delen veel van dezelfde functies als de normale stamcellen waaronder rust, resistentie tegen chemotherapie, op lange termijn zelf-vernieuwing en het vermogen om te differentiëren in verschillende cellijnen 7,8.

Verschillende studies ondersteunen het bestaan ​​van TICs bij eierstokkanker en de huidige inspanningen worden gedaan om het mechanisme (s) waarmee deze cellen ondersteunen het ontstaan ​​van tumoren 9-11 verduidelijken. Verschillende markers zijn voorgesteld om de eierstokken TICs met verbeterde tumorgeniciteit inclusief CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, en MyD88 identificeren, hoewel de exacte bijdrage van elke marker is onduidelijk en kan celtype specifieke 11-16 zijn. Terwijl een universele merker of set van merkers is niet eenduidig ​​vastgesteld voor ovariële TIC, hebben verschillende groepen die ovariale TICs vaker door het selecteren van CD44 +, CD133 + en / of cellen met hoge aldehyde dehydrogenase (ALDH) 13,17-21. CD44 is een transmembraan glycoproteïne dat fungeert als een receptor voor hyaluronzuur en reguleert diverse processen belangrijk tumorprogressie, zoals hechting, proliferatie, migratie, angiogenese en differentiatie 22. CD133 is een transmembraan glycoproteïne waarvan de functie is nog onduidelijk maar studies suggereren dat het plasmamembraan topologie 23 organiseert. ALDH, een intracellulair enzym dat de oxidatie van aldehyden katalyseert, kunnen de meest universal marker tics als hoge activiteit geïdentificeerd in stamcellen geïsoleerd uit verschillende weefsels en meerdere rollen zijn toegeschreven aan ALDH ondersteunen normale stamcellen en tics 24. Vanaf nu, CD133 en ALDH1 lijken de meeste reproduceerbare markers van ovariële TICs 13,21 zijn.

Naast inzicht de kenmerken tics, is er ook een grote inspanning om specifieke medicijnen die deze subpopulatie identificeren. Het terugkeren in verband met eierstokkanker kan te wijten aan het falen van de huidige chemokuren om met succes uit te roeien TICs. Hoewel het grootste deel van de tumor gevoelig voor bestaande therapieën worden TICs gedacht bestendige bij een dichtheid detecteerbaar met standaardmethoden worden. Ophelderen van de mechanismen van therapieresistentie en tumor recidief zijn van vitaal belang om de respons en de totale overleving van patiënten met eierstokkanker te verbeteren.

Hier worden de cultuur technieken beschreven thbij verrijken tics van gevestigde en primaire eierstokkanker cellijnen. De kweekomstandigheden hierin beschreven zijn gebruikt door verschillende groepen om de voortplanting van TICs of bolvormige cellen met stamcellen kwaliteiten 11,12,14,16,20 induceren. Hoewel er verschillende stamcelkweek media en supplementen gebruikt voor het verrijken TIC / sferoïden we gebruikten een serumvrij medium formule met EGF en FGF, maar zonder de toevoeging van B27 of N-2 supplementen. Deze supplementen, gewoonlijk gebruikt voor neuronale celkweek en verrijkend stamcellen, is aangetoond dat een mesenchymale fenotype 25,26 bevorderen en blijft er enige onzekerheid in het veld als of TIC heeft mesenchymale of epitheliale fenotype zijn tumorigene 27-29 . Om onzekerheden en variabelen te minimaliseren we ervoor gekozen om de meest voorkomende formule te gebruiken, omdat we te maken hebben met epitheliale eierstokkanker cellen.

Handhaving cellen in serumvrij medium in een laag beslag kolffaciliteert spheroïde vorming en ondersteunt de verspreiding van cellen met CD133 expressie en hoge ALDH activiteit. Ons werk heeft toonde verder aan dat cellen drijvende onder normale aanhanger omstandigheden ook een meer tumorigeen TIC bevolking kan vertegenwoordigen. Injectie van cellen die in deze voorwaarden athymische naakt muizen leidt tot hogere tumorigene potentieel vergeleken met cellen die in verbonden in aanwezigheid van serum. Veel informatie over de rol tics bij eierstokkanker initiatie, progressie, therapeutische respons en recidief kan worden verkregen door het gebruik van deze technieken.

Protocol

1. Traditionele Cultuur van Ovarian Cancer Cell Lines (Adherent voorwaarden) OPMERKING: Alle afhandeling van cellen en media moeten plaatsvinden in een steriele weefselkweek kap Bereid de traditionele media voor celkweek. Gebruik 1: 1 DMEM: F12 (+ L-glutamine, + 15 mM HEPES) en aangevuld met 10% hitte geïnactiveerd foetaal runderserum en 1% penicilline / streptomycine. Filter oplossing met 0,45 pm vacuüm filter. Bereid een traditionele polystyreen 75cm 2 weefselkweekfles gelabeld met de naam, de datum, en de passage nummer van de cellijn van interest.Remove de flacon van de cellen van ultra lage diepvries of vloeibare stikstof. Ontdooien door het plaatsen in 37 ° C waterbad gedurende 5 min. Transfer suspensie van flacon in een 15 ml centrifugebuis die 3 ml traditionele celkweekmedium (hierboven bereid). Centrifugeer suspensie bij 4 ° C gedurende 5 min bij 400 x g. Ondertussen, voeg 16 ml traditionele media voor celkweek aan kolf. Zuig supernatant. Met behulp van 2 ml traditionele media voor celkweek pipet cellen op en neer om los pellet en overdracht schorsing aan kolf. Zachtjes rots fles gelijkmatig te verdelen cells.Place kolf in bevochtigde celcultuur incubator ingesteld op 37 ° C en 5% CO2. Monitor cellen dagelijks tot 80% samenvloeiing wordt bereikt. Zodra de cellen 80% samenvloeiing splitsing van de cultuur 1: 2 in celcultuur motorkap. Zuig supernatant en wassen met warm fosfaat gebufferde zoutoplossing (zonder calcium en magnesium) (PBS). Voeg 1,5 ml trypsine-EDTA 0,25% en incubeer 3-5 minuten bij kamertemperatuur. Bereid 2 nieuwe polystyreen 75cm 2 flesjes en voeg 16 ml traditionele media voor celkweek aan elke kolf. Resuspendeer de cellen getrypsiniseerd in 4 ml traditionele celkweek media en aliquot gelijke volumes van elk van de nieuwe kolven. Plaats kolven bevochtigde celkweek incubator op 37 ° C en 5% CO2. Monitor cellen dagelijks tot 80% samenvloeiing wordt bereikt. Blijven cellen splitsen encultuur of bevriezen en bewaar bij -80 of in vloeibare stikstof. 2. Genereren van Meercellige Sferoïden van Ovarian Cancer Cell Lines met behulp van drijvende of hechtende cellen OPMERKING: Alle afhandeling van cellen en media moeten plaatsvinden in een steriele weefselkweek kap. Na het kweken van cellijnen onder traditionele kweekmethoden voor 2-3 passages (deel 1) door te gaan met de volgende stappen. Bereid stamcellen media. Gebruik 1: 1 DMEM: F12 (+ L-glutamine, + 15 mM HEPES) en vullen met 1% penicilline / streptomycine (tot een eindconcentratie van 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine), 1% knockout serum vervanging , 0,4% runderserumalbumine en 0,1% insuline-transferrine-selenium. Filter oplossing met 0,45 pm vacuüm filter. Supplement stamcellen medium met recombinant humaan epidermale groeifactor (EGF) en humane recombinante basische fibroblast groeifactor (FGF) voor een uiteindelijke concentratie van 20 ng / ml en 10 ng / ml. OPMERKING: Groeifactoren moet vers aan de stamcel media worden toegevoegd vlak voor gebruik. Maak floater TIC cultuur. Verwijder kolf van 80% confluent gekweekt in traditionele hechtende kweekomstandigheden. Verzamel media en alle zwevende cellen (enkel en aggregaten), waardoor de aanhanger bevolking achter, en over te dragen aan 50 ml polypropyleen centrifugebuis. Centrifugeer suspensie bij 4 ° C gedurende 5 min bij 400 x g. OPMERKING: drijvende cellen en aggregaten schijnbare 24-72 uur na hechtende cellen aan de kolf onder traditionele cultuur. Van een 80% confluente plaat terugvinden van ongeveer 1,0 – 5,0 x 10 5 levensvatbare drijvende cellen kan worden verwacht, afhankelijk van de cellijn. In deze studie het gemiddelde aantal drijvende cellen verzameld uit een 80% confluente adherente cultuur was: 5,0 x 10 5 ACI-23, 4,8 x 10 5 voor OVCAR5, 3,5 x 10 5 voor CAOV3 en 1,0 x 10 5 voor TGS- 3. Bij overdracht, multicellular spheroïde formatie in traditionele en floater TIC cultuur plaatsvindt binnen een paar dagen, hoewel dit is enigszins cellijn afhankelijk. Bijvoorbeeld ACI-23 cellen vormen aggregaten gemakkelijker dan CAOV3 cellen. Ondertussen bereiden een ultra lage aanhechtingsvlak polystyreen 75 cm 2 weefselkweekfles gelabeld met de naam, de datum, en de passage aantal cellijn. Voeg 10 ml stamcellen medium aangevuld met groeifactoren aan de kolf. Zodra centrifugeren is voltooid, aspireren media en overdracht pellet te laag beslag fles door het toevoegen van 6 ml stamcel media en op en neer pipetteren om pellet los te maken. Plaats kolven bevochtigde celkweek incubator op 37 ° C en 5% CO2. Monitor cellen elke 2-3 dagen tot bolvormige formatie te observeren. Maak traditionele TIC cultuur. Verwijder kolf van 80% confluent gekweekt in traditionele hechtende kweekomstandigheden. Zuig media en wassen met warm PBS. Voeg 1,5 ml trypsine EDTA 0,25% en incubeer 3-5min bij kamertemperatuur. Bereid een ultra lage aanhechtingsvlak polystyreen 75 cm 2 weefselkweekfles gelabeld met de naam, de datum, en de passage aantal cellijn. Voeg 10 ml stamcel medium, aangevuld met EGF en FGF, zoals beschreven in de kolf. Voeg 6 ml cel media voort aan de kolf met het trypsine. Pipet cel oplossing op en neer en de poging om de cellen los te maken uit de fles oppervlak. Transfer gehele volume van de cellen tot ultra lage bevestiging kolf met de 10 ml mobiele media in te dammen. Plaats de kolf in bevochtigde celkweek incubator op 37 ° C en 5% CO2. Supplement TIC culturen iedere 48-72 uur met een extra 2 ml stamcel media en vers EGF en FGF voor eindconcentraties van 20 ng / ml en 10 ng / ml. Monitor cellen tot 60-80% confluentie bereikt. Split culturen door het plaatsen van gelijke volumes in 2 nieuwe ultra low gehechtheid flacons en het toevoegen van verse stamcellen media tot een eindvolume van 18 ml te bereiken. Alternatiefly, centrifuge het gehele suspensie bij 4 ° C gedurende 5 min bij 400 x g. Resuspendeer cellen in stamcellen media aangevuld met EGF en FGF en verdeel eveneens in nieuwe ultra-lage bevestiging kolven. Cellen hoeven niet te worden gedissocieerd in enkele celsuspensies voor passage. LET OP: Op dit punt de culturen kan blijven worden gesplitst en beschaafde, bevroren, of experimenteel gemanipuleerd voor analyse. Bij 60-80% samenvloeiing werden de volgende concentraties van cellen opgehaald voor ACI-23: 8,0 x 10 6 voor Traditionele Adherent, 4,0 x 10 6 voor Traditionele TIC, en 5,0 x 10 6 voor Floater TIC culturen. Hoewel het misschien cellijn afhankelijk is, hebben we ontdekt dat 5-10 dagen in cultuur is optimaal voor TIC verrijking als het percentage van de CD133 + ALDH + cellen is laag binnen de eerste 3 dagen, pieken op 5-10 dagen, en neemt daarna weer op 14 dagen. 3. Productie van primaire ovariumcarcinoom cellijnen en Meercellige Sferoïdenvan chemoresistent Patient Ascites OPMERKING: Institutional Review Board goedkeuring werd verkregen voor dit protocol. Alle afhandeling van cellen en media moeten plaatsvinden in een steriele weefselkweek kap. Plaat ascitesvloeistof 1: 1 met traditionele celkweekmedium. Bereid media zoals beschreven in paragraaf 1 en voeg 10 ml aan verschillende traditionele polystyreen 75 cm 2 weefselkweekflessen. Ascitesvocht wordt doorgaans verstrekt in 1 L steriele vacuüm flessen; verwijder vacuüm cap. Voeg voorzichtig 10 ml ascites vloeistof kolf die 10 ml traditionele media en plaats in bevochtigde celkweek incubator op 37 ° C en 5% CO2. Laat staan ​​voor 72-96 uur, vóór het doen van een complete media-verandering. Veranderen media elke 2-3 dagen tot cellen te bereiken 60-80% samenvloeiing Zodra cellen te bereiken 60-80% samenvloeiing, 1: 2 gesplitst zoals beschreven in hoofdstuk 1. Start TIC culturen, zoals beschreven in hoofdstuk 2. OPMERKING: erytrocyten aanwezig in ASCITes worden verwijderd na de eerste media veranderen als ze niet-hechtend. Alle fibroblasten onderhavige grotendeels verwijderd na behandeling met trypsine zoals ze gevoeliger en heft met minimale blootstelling aan trypsine. Zuiverheid van eierstokkanker cellen werd bepaald met flowcytometrie analyse met antilichaam voor CA-125 (MUC16). 4. kleuring van cellen voor flowcytometrie Bevestiging van TIC Markers Verzamel TIC culturen. Transfer inhoud van de kolf in 50 ml polypropyleen centrifugebuis. Centrifuge suspensies gedurende 5 min bij 400 x g. Zuig media en wassen met warm PBS. Voeg 2 ml niet-enzymatische cel dissociatie oplossing incubeer 3-5 minuten bij 37 ° C en pipet op en neer te breken klonten en dissociëren in enkele cellen. Voeg 4 ml stamcel media. Verzamel adherente culturen. Zuig media en wassen met warm PBS. Voeg 3 ml niet-enzymatische cel dissociatie oplossing en incubeer 3-5 minuten bij 37 ° C. Voeg 3 ml traditionele celvoedingsbodems en pipet op en neer herhaaldelijk om cellen los van kolf en verzamelen in centrifugebuis. Centrifugeer zowel TIC en hechtende suspensies gedurende 5 min bij 400 x g. Verwijder supernatant en resuspendeer elke pellet in 1 ml PBS dat 3% foetaal runderserum. Incubeer bij kamertemperatuur 30 min. Ondertussen tellen aantal levensvatbare cellen met behulp van trypaanblauw. Observeren cellen onder de microscoop te bevestigen bolletjes kunnen worden gescheiden in afzonderlijke cellen. Label 5 x 1,5 ml Eppendorf buizen voor elk van de volgende cultuur voorwaarden: 1) ongekleurd (onbesmet controle voor compensatie), 2) ALDH (enkele vlek positieve controle voor compensatie), 3) CD133 (enkele vlek positieve controle voor compensatie), 4 ) ALDH + CD133 (experimenteel monster), en 5) DEAB ALDH + (negatieve controle voor de achtergrond fluorescentie in FL-1 en FL-4 kanalen, respectievelijk). Verdeel ongeveer 5 x 10 5 cellen per buizen # 1 – 4. Centrifuge ophangingen voor 5 min bij 400 x g. Aspireren supernatant en resuspendeer pellets in 500 pi Aldefluor Testbuffer. Voeg 10 ul DEAB (ALDH remmer) aan de buis # 5 voor experimentele negatieve controle. Voeg 5 ul geactiveerd Aldefluor reagens buis # 2 voor compensatie positieve controle en flick te mengen. Voeg 5 ul geactiveerd Aldefluor reagens buis # 4 voor experimentele analyse. Flick buis te mengen en onmiddellijk over te dragen de helft van het volume van de cellen van de buis # 4 in de buis # 5 (250 ul), die de DEAB bevat. Flick buizen goed te mengen. Incubeer alle buizen gedurende 30 – 45 minuten bij 37 ° C beschermd tegen licht. Flick buizen halverwege incubatietijd als cellen zullen naar de bodem. Centrifuge alle buizen gedurende 5 minuten bij 400 x g. Zuig supernatant en resuspendeer cellen in 500 pi Aldefluor Testbuffer. Bij buizen met CD133 kleuring (# 3 en # 4), voeg CD133-APC 01:11 direct in Aldefluor assaybuffer. Incubeer 15 minuten op ijs beschermd tegen licht. Centrifuge CD133 buizen gedurende 5 minuten bij 400 x g. Een keer wassen met500 ui Aldefluor assaybuffer. Resuspendeer cellen in 500 pi Aldefluor assaybuffer, respectievelijk. Schorsingen filter in individuele polystyreen ronde bodem buizen met cel zeefdop. Zorg ervoor dat het volledige volume wordt gefilterd door de dop. Gebruik een flowcytometer de celpopulatie analyseren. Gebruik buizen # 1-3 voor het instellen van een vergoeding controles. Met behulp van voren en side-scatter parameters, de poort van de cellen, en zorg ervoor dat cellulaire puin uit te sluiten. Vestigen ALDH + en CD133 + dubbele cellen met behulp van FL-1 en FL-4 kanalen, respectievelijk. Met behulp van een cytometrieanalyse programma, bevestigt de kweekomstandigheden verbeterde het percentage van TIC cellen als de TIC-rijke culturen moet hoger kleuring voor deze twee markers hebben. OPMERKING: Naast CD133 en ALDH, andere markersof eierstokkanker tics worden geanalyseerd met aantal markeringen in één monster afhankelijk van de mogelijkheden van flowcytometer. 5. In vivo </em> subcutane injecties om tumorigeniciteit van celpopulaties Bevestig OPMERKING: Institutional Review Board goedkeuring werd verkregen voor dit protocol. Verdeel athymische vrouwelijk naakt muizen 6-8 weken oud zijn in experimentele groepen in kooien van 3 en laten acclimatiseren voor een paar dagen voorafgaand aan injecties. Volg muizen onder menswaardige experimentele richtlijnen per NIH Animal Care en gebruik Committee; bewaken lichaamsgewicht, fysieke verschijning waaronder gewichtsverlies of krijgen meer dan 20%, uitgehongerd verschijning, diarree of dermatitis en euthanaseren muizen montage deze criteria door CO 2 verstikking. Verzamel culturen zoals beschreven in paragraaf 2. Hersuspendeer elke cel populatie in 1 ml PBS. Count levensvatbare cellen met trypan blauw assay. Bereid 15 ml centrifugebuizen. Voor drievoud maatregelen voeg 1,5 x 10 6 levensvatbare cellen verdund in 2 ml PBS aan elke buis (wordt 5 x 10 5 cellen in een volume van 0,5 ml subcutaan geïnjecteerd worden rechts flank van elke muis). Bereid 0,5 ml PBS alleen controlemuizen. Met 27 G naalden subcutaneouslyinject 0,5 ml celsuspensie traditionele adherente culturen traditionele TIC culturen floater TIC culturen of PBS in de rechterflank van elk 3 muizen per groep. Terug muizen om de oorspronkelijke kooien na injectie. Weeg muizen en meet elke voelbare tumoren in twee dimensies tweemaal weeklyby Vernier remklauw, tot oprichting van lengte en breedte. OPMERKING: Tumor latency is meestal 20-50 dagen afhankelijk van de cellijn. Bereken tumor natte volume van standaardmethoden (V = (breedte) 2 x lengte / 2). OPMERKING: Hoewel deze studie vergeleken tumorigeniciteit van TICs versus hechtende cellen voor de eerste generatie alleen, heeft in vivo seriële passage van TICs onder vergelijkbare omstandigheden gegroeid zijn afgerond door anderen 11,20.

Representative Results

Gevestigde eierstokkanker cellijnen en primaire ascites cellijn gekweekt in traditionele hechtende kweek in aanwezigheid van serum vertonen bevestigd geplaveide morfologie, terwijl dezelfde cellen gekweekt in kweek TIC statusindicatie drijvende bolvormige morfologie, gebruikelijk in TIC populaties. Helderveld beelden weergegeven in figuur 1 A duidelijk de morfologische verschillen in de cultuur. Figuur 1B toont de gedifferentieerde morfologie bereikt na opnieuw platen van de ACI-23 en TGS-3 TIC in traditionele aanhanger voorwaarden. Slechts 24 uur na uitzetten opnieuw in hechtende omstandigheden, een meerderheid van de multicellulaire sferoïden dissociëren en hechten aan het oppervlak, lijkt typisch hechtende cellen. Om te controleren of de TIC voorwaarden te verrijken voor cellen met stamcellen markers flowcytometrie analyse werd uitgevoerd met behulp van twee gemeenschappelijke markers van ovariële TICs – CD133 expression en ALDH activiteit. Puntdiagrammen weergegeven in figuur 2 A markeert het verhoogde percentage van CD133 + cellen in lage gehechtheid, serum-vrije omstandigheden. Ook de activiteit van de ALDH enzym hoger in deze omstandigheden in vergelijking met traditionele hechtende kweekomstandigheden. Hoewel de traditionele adherente culturen bevatten CD133 + cellen, de verhogingspercentages onder omstandigheden die sferoïde vorming bevorderen. Analyse van een pluripotentie marker, TRA-1-60, leent verdere steun die de TIC voorwaarden te verrijken voor TICs, Figuur 2 B. Kwantificering in figuur 2 C toont aan dat dubbel positieve (CD133 + ALDH +) ACI-23 cellen grotendeels beperkt tot culturen onder TIC verbeteren omstandigheden gegroeid. Veranderingen in de eiwitniveaus van verschillende transcriptiefactoren die optreden in de ACI-23 cellen na vijf dagen kweken in de TIC omstandigheden werden eveneens onderzocht. Een progressieve toename in elk van de markers is te zien van de traditionele naar TIC voorwaarden floater in vergelijking met de relatief lage niveaus in de aanhanger cultuur, Figuur 2 D. Interessant menselijke ascites cellijn gekweekt in verschillende omstandigheden om de hoogste merker fenotype onder de traditionele TIC omstandigheden met weinig tot geen kleuring aanwezig in de drijver TIC voorwaarden figuur 2E. De tumorigeniciteit van de TIC kweekomstandigheden werd gevalideerd door subcutane injecties van gelijke aantallen levensvatbare cellen verkregen uit alle omstandigheden in cohorten van athymische naakt muizen. Figuur 3 toont dat ACI-23 (A, B) en OVCAR-5 (C) cellen van traditionele hechtende kweken minder tumorigene dan die van de TIC kweken. Merk op dat de drijver TIC kweken geproduceerd grotere tumoren in een kortere tijd dan de traditionele hechtende of traditionele TIC culturen. Deze data suggereren dat zelfs met een bescheiden toename van ovariële TIC markers, er een dramatische fenotypische verandering. Maar bij andere cellijnen (niet weergegeven) traditionele TIC kweken waren tumorigene dan de traditionele hechtende en floater TIC kweekcellen. Figuur 1. Sferoïde ontwikkeling in verschillende kweekomstandigheden. (A) Vastgestelde eierstokkanker cellijnen (ACI-23, OVCAR-5 en CAOV3) en primaire patiënt afgeleide ascites cellen (TGS-3) gekweekt in laag kolven bevestiging met serumvrij stamcel media gemakelijk meercellige bolletjes. Beelden tonen traditionele aanhangend kweekomstandigheden behouden epitheliale geplaveide morfologie in ACI-23, OVCAR-5, CAOV3 en TGS-3 cellen, terwijl dezelfde cellen gevormd sferoiden binnen 96 uur in TIC voorwaarden. Schaalbalk 100 micrometer. (B) Bij blootstelling 24 uurde traditionele aanhangend kweekomstandigheden, de TIC cultuur morfologiën geven een gedifferentieerd fenotype lijkt op de originele aanhanger morfologie. Schaalbalk 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 2. Low-attachment, serumvrije condities verrijken voor cellen met TIC markers. (A) Flow cytometrie analyse van ACI-23 cellen met APC geconjugeerd CD133 antilichaam toont een verhoogd percentage CD133 + cellen in lage kolven bevestiging met serumvrij steel mobiele media. Flowcytometrieanalyse behulp Aldefluor test toont verhoogde ALDH activiteit in cellen gekweekt in laag attachment kolven met serum-vrij stamcellen media. CD133 negatieve controle bevat geen antilichaam en ALDH negatieve control is de geactiveerde substraat in aanwezigheid van de ALDH inhibitor (DEAB). (B) Analyse met behulp van FITC-geconjugeerd TRA-1-60 antilichaam demonstreert hoogste percentage van de TRA-1-60 + cellen in de floater TIC omstandigheden in ACI-23 cellen. Negatieve controle bevat geen antilichaam. (C) CD133 + ALDH + cellen zijn het hoogst in de traditionele TIC en floater TIC omstandigheden in de ACI-23 cellijn. Error bars: SEM, n = 6, * p <0,05. (D) Western blot analyse toont toename eiwitniveaus transcriptionele merkers van stamcellen in de ACI-23 cellen gekweekt in TIC omstandigheden gedurende 5 dagen. Gehele cellysaten (50 ug) werden geanalyseerd met GAPDH als beladingscontrole. (E) Vertegenwoordiger puntdiagrammen van TGS-3 primaire ascites cellen als in A geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "always"> Figuur 3. Low-attachment, serumvrije condities verrijken voor cellen met verhoogde tumorgeniciteit. (A) 5 x 10 5 levensvatbare ACI-23 cellen werden subcutaan geïnjecteerd in athymische naakt muizen in drievoud. Muizen werden gewogen en de tumoren gemeten met schuifmaat tweemaal per week. A = Traditionele aanhangend cultuur, F = Floater TIC cultuur, S = Traditionele TIC cultuur. * P <0,05. (B) Vertegenwoordiger beelden van tumoren gevormd uit ACI-23 na 25 dagen met behulp van cellen onder verschillende kweekomstandigheden gegroeid. (C) 5 x 10 5 levensvatbare OVCAR-5 cellen werden subcutaan geïnjecteerd in athymische naakt muizen in drievoud en gecontroleerd als in A. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

De hier beschreven protocol biedt een efficiënte en consistente werkwijze voor het verrijken van kweken van cellen met stamcel kenmerken van gevestigde eierstokkanker cellijnen en toepassing primaire patiëntenmonsters. Deze methode met succes verrijkt voor TIC's in een verscheidenheid van cellijnen. Zij zorgt voor de tijdige identificatie van factoren die te verrijken voor een TIC en / of tumorigeen fenotype, zonder de tijd nemen om fysiek sorteren van de TIC's van niet-TIC's binnen de populatie. Op deze wijze kan de relatieve niveaus van verschillende signaalwegen worden beoordeeld op hun bijdrage aan de TIC fenotype door vergelijking traditionele adherente culturen kweken met verschillende functionele assays TIC. Als een zuivere populatie TIC gewenst, kan isolatie gemakkelijk worden bereikt door een fluorescentie ondersteunde of magnetische sortering stap in de flowcytometrie protocol.

Het is belangrijk om in gedachten te houden, echter, dat de expressie van TIC markers, zoals CD133, CD44 of ALDH kan variëren tussen cellijnen en patiënt monsters zelfs van hetzelfde type tumor. Zo vonden we dat de OVCAR-5 cellen hebben een hogere expressie van CD44 ten opzichte van CD133, terwijl het omgekeerde geldt voor ACI-23. Het is daarom relevant om te vertrouwen op tumorinitiatie bij muizen en flowcytometrie analyse als definitief van TIC aanwezigheid. Naar aanleiding van dit protocol werd hoog ALDH activiteit consistent waargenomen bij eierstokkanker cellen werden gekweekt in stamcel voorwaarden. Interessant, CD133 expressie consequent hoger in ACI-23 cellen gekweekt in de traditionele TIC kweekomstandigheden, terwijl ALDH is het hoogst in floater TIC voorwaarden. Daarentegen tonen de TGS-3 primaire ascites cellen een kleine toename CD133 positiviteit onder vlotter TIC omstandigheden, maar een opmerkelijke toename van ALDH activiteit onder traditionele TIC omstandigheden. Deze bevindingen wijzen op de heterogeniteit van eierstokkanker cellen en de plasticiteit vaak geassocieerd met TICs. Ter verdere ondersteuning van de CAOim dat deze methoden te verbeteren TICs, werd de verrijking van TRA-1-60 positieve cellen ook waargenomen. TRA-1-60 is een pluripotentie marker en is gebruikt om embryonale carcinomen van de eierstokken en de testikels te identificeren evenals prostaatkanker TICS 30-32. Hoewel onze werkwijze succesvol geweest bij tal cellijnen, is het mogelijk dat de standaard TIC omstandigheden misschien beter geschikt paar eierstokkanker cellen, terwijl de gewijzigde drijver omstandigheden beter verrijken TICs andere eierstokkanker celpopulaties. Dit onderstreept opnieuw de verwachte heterogeniteit binnen zowel patiënten afkomstige en gevestigde eierstokkanker cellijnen.

Naast celoppervlak markers er verschillende transcriptiefactoren die zijn aangetoond eierstokkanker TIC waaronder Nanog, Sox2, Oct-4 11 karakteriseren, hoewel deze markers zijn niet specifiek voor eierstokkanker TIC en factoren belangrijk voor embryonale stamcel pluripotentie plaats vertegenwoordigen en differentiatie 33,34. Onderzochten we de veranderingen in eiwit niveaus van deze factoren en vond dat Nanog verhogen in TIC kweekomstandigheden, in overeenstemming met anderen 13,35 evenals CD133, TRA-1-60, en CD117. Een menselijke stamcellen marker cDNA reeks toonde verder aan een toename van de CD133, Nanog, Melk, en PODXL genen in de TIC omstandigheden in vergelijking met traditionele aanhanger voorwaarden. Belangrijk is, moet worden opgemerkt dat, zoals bij celoppervlak markers, transcriptionele factoren geassocieerd met ovarian TIC kan variëren tussen cellijnen en patiënt monsters.

We hebben waargenomen dat de cellen meer tumorigene zijn en expressie hogere stamcel markers als ze inherent niet-adherente in vitro (bijv drijvende cellen die niet gemakkelijk kan hechten aan een hechtende plaat). In cultuur cellijnen zoals ACI-23 hebben typisch veel levensvatbare drijvende cellen en / of cellen die verticaal groeien in een stapeling wijze onder traditionele cultuur Conditionen. Hoewel succesvolle verrijking van TICs van zwevende cellen en aggregaten van toepassing op relatief weinig cellijnen misschien ook die in de huidige studie en OVCAR-3 12, onze bevindingen suggereren dat dit misschien een meer tumorigeen bevolking vertegenwoordigen. Daarom is het oogsten van de "zwevende" populatie cellen gekweekt in standaard weefselkweekplaten en media kan dienen als een alternatieve methode TIC verrijking op cellen die slecht aangepast aan commerciële stamcellen media.

Gebruik van de verschillende kweekmethoden in dit manuscript snelle verrijking van TIC populaties en een beter begrip van wat factoren ondersteunen dit phenotype in verschillende cellen mogelijk. Huidige toepassingen van deze methode zijn kenmerkend die signaalroutes zijn essentieel voor de voortplanting van deze unieke populatie van cellen ondersteunen. De resultaten van deze studies zal helpen om mechanismen van tumor progressie en terugval te verduidelijken.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. John Risinger and Memorial Health University Medical Center, Inc. for generously providing the ACI-23 cell line. The authors acknowledge financial support through the Postdoctoral Research Training (PRAT) Award to C. House from The National Institute for General Medical Sciences.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
75 cm2 Ultra – Low Attachment Flask Corning 3814
75 cm2 Tissue Culture Flask Sarstedt 83.1813.002
Aldefluor Kit Stemcell Technologies 1700
CD133-APC Miltenyi Biotec Inc. 130-090-826
Fibroblast Growth Factor – Basic human recombinant Sigma-Aldrich F0291 Prepared according to manufacturer's instructions
Epidermal Growth Factor – human recombinant Sigma-Aldrich E9644 Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS
DMEM:F12 (+L-Glutamine, +5 mM HEPES) Gibco 11330-032
1X Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (Without Calcium and Magnesium) Corning cellgro 21-031-CV
0.25% Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution Corning cellgro 25-056-CI
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418-10G
Insulin-Transferrin-Selenium Gibco 51500-056
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828010
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) Gemini 100-106
Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 micron) Nalgene 450-0045
15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube Corning 430052
50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube Falcon 352098
Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl Lonza 17-942E
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Coleman, R. L., Monk, B. J., Sood, A. K., Herzog, T. J. Latest research and treatment of advanced-stage epithelial ovarian cancer. Nat Rev Clin Oncol. 10, 211-224 (2013).
  2. Ushijima, K. Treatment for recurrent ovarian cancer-at first relapse. J Oncol. 2010, 497429 (2010).
  3. Erickson, B. K., Conner, M. G., Landen, C. N. The role of the fallopian tube in the origin of ovarian cancer. Am J Obstet Gynecol. 209, 409-414 (2013).
  4. King, S. M., et al. The impact of ovulation on fallopian tube epithelial cells: evaluating three hypotheses connecting ovulation and serous ovarian cancer. Endocr Relat Cancer. 18, 627-642 (2011).
  5. Flesken-Nikitin, A., et al. Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche. Nature. 495, 241-245 (2013).
  6. Paik, D. Y., et al. Stem-like epithelial cells are concentrated in the distal end of the fallopian tube: a site for injury and serous cancer initiation. Stem Cells. 30, 2487-2497 (2012).
  7. Connor, M. L., et al. Cancer stem cells: A contentious hypothesis now moving forward. Cancer Lett. 344, 180-187 (2014).
  8. Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5, 275-284 (2005).
  9. Bapat, S. A., Mali, A. M., Koppikar, C. B., Kurrey, N. K. Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer. Cancer Res. 65, 3025-3029 (2005).
  10. Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11154-11159 (2006).
  11. Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).
  12. Wang, L., Mezencev, R., Bowen, N. J., Matyunina, L. V., McDonald, J. F. Isolation and characterization of stem-like cells from a human ovarian cancer cell line. Mol Cell Biochem. 363, 257-268 (2012).
  13. Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130, 29-39 (2012).
  14. Meng, E., et al. CD44+/CD24- ovarian cancer cells demonstrate cancer stem cell properties and correlate to survival. Clin Exp Metastasis. 29, 939-948 (2012).
  15. Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8, 158-166 (2009).
  16. Chen, J., et al. Evaluation of characteristics of CD44+CD117+ ovarian cancer stem cells in three dimensional basement membrane extract scaffold versus two dimensional monocultures. BMC Cell Biol. 14, 7 (2013).
  17. Guo, R., Wu, Q., Liu, F., Wang, Y. Description of the CD133+ subpopulation of the human ovarian cancer cell line OVCAR3. Oncol Rep. 25, 141-146 (2011).
  18. Curley, M. D., et al. CD133 expression defines a tumor initiating cell population in primary human ovarian cancer. Stem Cells. 27, 2875-2883 (2009).
  19. Baba, T., et al. Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133+ ovarian cancer cells. Oncogene. 28, 209-218 (2009).
  20. Liao, J., et al. Ovarian cancer spheroid cells with stem cell-like properties contribute to tumor generation, metastasis and chemotherapy resistance through hypoxia-resistant metabolism. PLoS One. 9, e84941 (2014).
  21. Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71, 3991-4001 (2011).
  22. Jaggupilli, A., Elkord, E. Significance of CD44 and CD24 as cancer stem cell markers: an enduring ambiguity. Clin Dev Immunol. 2012, 708036 (2012).
  23. Irollo, E., Pirozzi, G. CD133: to be or not to be, is this the real question. Am J Transl Res. 5, 563-581 (2013).
  24. Ma, I., Allan, A. L. The role of human aldehyde dehydrogenase in normal and cancer stem cells. Stem Cell Rev. 7, 292-306 (2011).
  25. McLean, K., et al. Human ovarian carcinoma–associated mesenchymal stem cells regulate cancer stem cells and tumorigenesis via altered BMP production. J Clin Invest. 121, 3206-3219 (2011).
  26. Amara, I., Touati, W., Beaune, P., de Waziers, I. Mesenchymal stem cells as cellular vehicles for prodrug gene therapy against tumors. Biochimie. , (2014).
  27. Brabletz, T. EMT and MET in metastasis: where are the cancer stem cells. Cancer Cell. 22, 699-701 (2012).
  28. Latifi, A., et al. Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors. PLoS One. 7, e46858 (2012).
  29. Liu, S., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem Cell Reports. 2, 78-91 (2014).
  30. Malecki, M., et al. TRA-1-60(+), SSEA-4(+), Oct4A(+), Nanog(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Ovaries. J Stem Cell Res Ther. 2, (2012).
  31. Malecki, M., Tombokan, X., Anderson, M., Malecki, R., Beauchaine, M. . TRA-1-60(+), SSEA-4(+), POU5F1(+), SOX2(+), NANOG(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Testes. J Stem Cell Res Ther. 3, 10-4172 (2013).
  32. Rajasekhar, V. K., Studer, L., Gerald, W., Socci, N. D., Scher, H. I. Tumour-initiating stem-like cells in human prostate cancer exhibit increased NF-κB signalling. Nat Commun. 2, 162 (2011).
  33. Loh, Y. H., et al. The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells. Nat Genet. 38, 431-440 (2006).
  34. Tay, Y., Zhang, J., Thomson, A. M., Lim, B., Rigoutsos, I. MicroRNAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation. Nature. 455, 1124-1128 (2008).
  35. Lee, M., et al. Prognostic impact of the cancer stem cell-related marker NANOG in ovarian serous carcinoma. Int J Gynecol Cancer. 22, 1489-1496 (2012).

Tags

Ovarian CancerTumor-initiating CellsTICsIn Vitro EnrichmentSphere FormationTumorigenicityStem Cell MarkersCD133ALDHLow AttachmentSerum-free MediaGrowth FactorsAdherent CellsNon-adherent CellsFloater CellsSignaling PathwaysDrug Targeting

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
House, C. D., Hernandez, L., Annunziata, C. M. In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells. J. Vis. Exp. (96), e52446, doi:10.3791/52446 (2015).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image