JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medizin

Farelerde Safra Kanalı ligasyonu: Obstrüktif Kolestaz tarafından İnflamatuar Karaciğer Hasarı ve Fibrozis indüksiyonu

Published: February 10, 2015
doi:
10.3791/52438
, , , , , ,
1Institute of Molecular Pathobiochemistry, Experimental Gene Therapy and Clinical Chemistry,RWTH Aachen University, 2Institute for Laboratory Animal Science and Experimental Surgery,RWTH Aachen University, 3Department of Medicine III,RWTH Aachen University

Summary

Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

Abstract

En omurgalılar, karaciğer absorbe yağ emülsifiye ve bilirubin ve diğer metabolik ürünlerin vücuttan yanı sıra ince bağırsakta lipidlerin sindirimi sağlamak için gerekli olan safra üretir. Karaciğerde, ekstrahepatik safra yollarının tıkanması deneysel kolestaz ve inflamasyon periportal alanlardan kaynaklanan güçlü bir fibrotik reaksiyonu sonucu yol açar patolojik olaylar zincirini başlatır karmaşık. Bu nedenle, safra kanalının cerrahi ligasyon kemirgenlerde obstrüktif kolestatik hasara yol ve uygunsuz safra akışı tarafından uyarılan bu patofizyolojik mekanizmaları altında yatan moleküler ve hücresel olayları incelemek için en sık kullanılan model haline gelmiştir. Son yıllarda, farklı cerrahi teknikler özel araştırma soruları için yeniden bağlanma ya da re-anastomoz safra kanalı ligasyonu (BDL) sonra, örneğin, kısmi BDL veya diğer mikrocerrahi yöntemleri izin ya bu tarif edilmiştir. Ancak, en sık kullanılan model 21-28 gün sonra güçlü bir fibrotik yanıtı uyaran koledok tam tıkanması olduğunu. ölüm oranı nedeniyle enfeksiyöz komplikasyon veya teknik yanlışlıklar yüksek olabilir. Burada 1959 yılında Russel ve Burch tarafından öne hayvan refahı için 3R kural uyarınca bir derece tekrarlanabilir fibrotik tepkisine neden farelerde BDL modeli için detaylı bir cerrahi prosedür sağlamak.

Introduction

Karaciğer fibrozu matrisi üreten gelmiş hepatik yıldız şeklinde hücreler karmaşık bir etkileşim ağının ve karaciğer yerleşik ve nüfuz eden hücreler, kan hücreleri 1,2 çeşitli kaynaklanan aşırı üretimi ve hücre dışı matris (ECM) birikmesi olarak tanımlanır. Hepatik fibroz farklı uyarılara bir çok neden olabilir, ancak fibrozun altında yatan moleküler mekanizmaların, genel olarak çok benzerdir. Karaciğer hasarı takiben, moleküler ve hücresel değişikliklerin bir çok orkestra programı başlatılır. Bu programda inflamatuar sinyaller, monosit / makrofajlar ve hepatik stellat hücreler arasında yakın bir etkileşim oluşur miyofibroblastlar, ECM birikimi ve karaciğer doku bütünlüğü 3 ardışık anatomik ve fonksiyonel değişikliklere stellat hücre aktivasyonu ve transdiferansiyonun uç sonuçlarına. Hepatik stellat hücrelerin aktivasyonu, özellikle karaciğer ile inflamatuar sinyalleri ve etkileşimleri ile tahrik edilir(Kupffer hücreleri örneğin) yerleşim makrofajlar. Patojen ilişkili moleküler desenleri gibi Toll benzeri reseptörler gibi özel örüntü tanıma reseptörleri tarafından tanınan bu inflamatuar süreci 3 sürücü inflamatuar sitokinler ve kemokinlerin çok sayıda ifadesini ve salgılanmasını tetikleyen farklı yollar karmaşık bir ağ üzerinden sinyal aktif olduğunda. Hastalık üreten faktör çıkarıldığında inflamatuvar yanıt ve oluşan hepatik hakaret geçicidir. Yaralanma devam ederse aksine, kronik inflamasyon karaciğer ve skar dokusu oluşumu ile normal karaciğer parankimi progresif yerine sonuçlanan ön planda ifade ve ECM kalabalıklar birikimi içinde gelişir.

İnsanlarda karaciğer fibrogenez dünya çapında bir klinik sorun olduğundan, akut ve kronik karaciğer yetmezliği birkaç deneysel kemirgen modelleri, son on yılda kurulmuştur. Mu iseDenizel sistemi, örneğin, ortak modeller kritik etkileyen farklı hepatotoksiktir- çeşitli yönetim, ortak safra kanalı ligasyonu, bağışıklık aracılı karaciğer hasarı indüksiyon ve gen defektleri hedeflenen tanıtım veya transjenlerin tersi aşırı ifadesi vardır Karaciğer fibroz 4 patogenezinde sinyal yolları.

Kemirgenlerde koledok ligasyonu yıllardır 5-8 araştırma deneysel prosedür olarak yapılmıştır. Kemirgenlerde uzun süreli safra kanalı ligasyonu (BDL) için ilk yüksek tekrarlanabilir protokol zaten fazla üç yıl önce 9 şimdi sunuldu. Bu protokolde, kanülasyon / obstrüksiyon ve ligasyonu insan biliyer siroz 9 gözlenenler ile karşılaştırılabilir olmuştur morfolojik değişikliklerle sıçanlarda sirozu yüksek verim neden olmuştur. ilgili protokol cerrahi prosedür, nispeten hızlı bir şekilde uygulanabilir, basitVe hayvanların hayatta kalma oranları 95 üzerinden% ile yüksektir. Klasik sıçan kanülasyon / tıkanıklık protokolde, 2 cm kısa bir kesi sadece kılıç şeklinde süreci altında yapılır. Bundan sonra, bir kanül safra kanalının yakın kısmının içine konulduğu ve ipek dikiş ile konumunda sabitlenir. Bir sonraki adımda, kanülün distal kısmı sağ alt kadranda 9 deri orta hat kesi alt ucundan koymak ve gömülü, 3 knot ile tıkalı. Sonunda, karın kapatılır ve hayvanlar iyileşmek üzere izin verilir. Ligasyon protokolü, fareler ya da ligatures 9 arasında safra kanalı diseksiyonu olmadan ya koledok ligasyonu çift tabi tutulmaktadır.

Bu deneysel model, iyi kabul ve karaciğer kolestaz ve fibrozis ikna etmek laboratuvarlarda yüzlerce dünya çapında kullanılmaktadır. Bu intrahepatik safra epitel hücre çoğalması, miyofibroblastik differentiatio uyarmaktadırPortal fibroblastların n etrafında ECM 10,11 son derece tekrarlanabilir, masif ifade ve birikimi ile sonuçlanan, safra epitel hücreleri çoğalan. Bu nedenle, sıçan ve farelerde bu modelin uygulanması hepatik inflamasyon ve fibrozis patogenezi anlamak amaçlayan bilim adamları arasında popüler ediliyor.

Laboratuvarımızda, biz kapsamlı karaciğer fibrogenez özel moleküler ve hücresel yönlerini araştırmak ve yeni antifibrotik kavram ve uyuşturucu 12-15 sınamak amacıyla çeşitli deneysel çalışmalarda sıçanlarda geçmişte bu protokolü kullanılır.

Son zamanlarda, biz kemirgen sisteme bu metodoloji adapte ve safra kanalı ligasyonu cerrahisi de farelerde 16-18 düşük varyasyon ve mortalite ile zamana bağlı fibrozis kurmak için cazip bir ortalama olduğunu bulundu. Hayvanların küçük boyutu, ancak, anestezi ile ilgili bazı önemli değişiklikler, cerrahi interv nedeniyleşayan ve tedavi sonrası gözlem, bu modelde, güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için gereklidir. tam uyum aşağıdaki protokol ve beraberindeki bir video belgelerinde özetlenmiştir.

Protocol

NOT: Tüm deneyler resmi devlet hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (LANUV, Recklinghausen, Almanya) tarafından onaylanmıştır. fareler Laboratuar Hayvan Bilimi Dernekleri Federasyonu'nun için (FELASA) kurallarına göre özel-patojen içermeyen koşullar altında muhafaza edilmektedir. Tüm deneyler (Sağlık yayın 8. Edition Ulusal Enstitüleri, 2011) 'Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı Kılavuzu' hayvanların korunması ile ilgili olarak Alman federal yasalar uyarınca yapılmıştır. 1. Cerrahi öncesi Hazırlık NOT: temiz ama steril olmayan koşullarda tüm işlemleri yürütmek. Ameliyat gerçekleştirmek için kullanılan bu tür cerrahi forseps, makas, ve Colibri retraktor gibi tüm araçlar ve diğer yeniden ekipman hayvanlarda cerrahisine yönelik kurumsal kurallarına tamamen uygun olan protokollere göre kullanımdan önce sterilize edilmelidir., Gerekli reaktifler, malzeme ve ekipman ayrıntılı bir listesi için, Belirli Malzemeleri / Ekipman listesine bakınız. Tam deney sırasında, sıvı geçirmeyen, kendinden yapışkanlı perdeler genel kapağı operasyon alanı sürekli anestezi sistemine bağlı 37 ° C arasındaki bir sıcaklıkta, bir sıcak tutma levhasının üzerinde hayvan tutmak ve. Düzgün tüm instrumentations ve ameliyat öncesi deney sırasında kullanılan çözümleri (Şekil 1) düzenlemek. Anestezinin indüksiyonu için 4 L / dk'lık bir akış hızında% 100 oksijen 4 hacimce% izofluran teneffüs ile fare anestezisi. Aşağıdaki hayati kriterler ulaşıldığında anesthetization derinliği yeterlidir: Düzenli spontan solunum, ayak parmakları arasında ağrı uyaranların ayarladıktan sonra hiçbir refleks ve ağrı yanıt. Bir elektrikli tıraş makinesi kürk ile fare karın kürk Tıraş ve göz ve n kullanımı ile kurumasını gözleri korumakose merhem. , 37 ° C ısıtılmış sıcak plaka üzerinde fare koyun Fluovac anestezi sistemi Fluovac maskesi fare burun yerleştirin ve ipek bant çizgili hayvanın bacakları düzeltmek. 1 L / dakikalık bir akış hızında% 100 oksijen 1.5-3 hacimce% izofluran teneffüs ettirilerek fare anestezi bakımı ve buprenorfin çözeltisi (0.1 mg / kg BW% 0.9 NaCI solüsyonu içinde eritilmiş), intraperitonal enjeksiyon yoluyla ameliyat analjezi induct . Derinin ameliyat öncesi tedavi için alkollü çözümü kullanmak için hazır antiseptik bir standart ile nemlendirilmiş bir gazlı bez bez ile traş karın cildi sterilize. Not: Bizim protokollerde bir poli-alkol cilt antisepticum kullanın. Bu hayvanların korunması ve Laboratuar Hayvan Bilimi Dernekleri Federasyonu'nun için yönergelerine ilişkin Alman federal yasa ile tam uyumludur. Bu antiseptik% 70 ihtiva eder (h / h) 2-propanol, bütan-1,3.diol ve sarı kinolin izleri ve perfumör. 2. Cerrahi İşlemleri 11,5 cm cerrahi makas ile aynı anda kutis artı fasya keserek yaklaşık 2 cm uzunluğunda bir orta hat laparotomi ile karın açın. Bir serpme olarak makas kullanılarak periton üstüne bağ dokusu incelemek. Periton boşluğuna açmak için linea alba boyunca periton kesin. , Sternum bir tutma sütür takmadan dikiş filamanın yükselterek ve Fluovac maske üstüne sabitlemek boşluğu büyütün. Periton boşluğuna bir Colibri Retraktör (Şekil 2) takarak çalışma alanını yaymak. Bunun ventral tarafı diyaframa sopalarla ve hilum açıkça görülebilecek şekilde bir nemli (% 0.9 NaCl çözeltisi) pamuklu çubukla karaciğer kaldırın. Gut (Şekil 3) kaudal hareketi tarafından safra kanalı Açığa. Dikkatlice safra kanalını ayırınBir mikro-çentikler forseps (Şekil 4A) kullanarak portal ven ve hepatik arter yan. Safra etrafında 5-0 dikiş yerleştirin ve iki cerrahi knot ile sabitleyin. Takviyelemede knot safra kanalı (Şekil 4B) kesilmesinin olmadan etkili tıkanıklığı sağlamak için sürekli çekiş gücü artırır. Aynı şekilde, ikinci kafa ligasyon ekleme ancak (Şekil 4C) ile safra kanalı incelemek yoktur. Aksi takdirde safra kaçağı, bir düğüm güvenli değilse, ve hayvanlar hiçbir kolestazisli deneyim ama ciddi peritonit geliştirmek önemli bir riski vardır. , Dikişler (Şekil 4D) uçlarını kesin sternum düşürmek ve retraktörü çıkarın. % 0.9 NaCl solüsyonu ile periton boşluğuna durulayın ve fizyolojik pozisyonlara karın organları değiştirin. Yakın hem karın tabakaları 6-0 Mersilk ayrı çalışan sütür ile (periton ve kutis artı facia). E Cutsütür nds ve antiseptik solüsyon ile ıslatılmış bir gazlı bez çubukla operasyon alanını sterilize. NOT: İlk defa ameliyat yaparken, 16X-20X büyütmede bir cerrahi mikroskop altında tüm prosedürleri uygulayın. Bu safra kanalının daha iyi tanınmasını izin verir ve açıkça portal ven ve hepatik arter (Şekil 5 ve 6) ayıran. Bazı laboratuvarlar, iki bitişik harfler arasında safra kanalının diseksiyonu önerilmektedir. Safra kanalı disseke zaman knot biri potansiyel sızıntı şiddetli akut peritonit, asit ve sistemik endotoksemide neden olur, çünkü sağlam safra kanalı bırakın. 3. Ameliyat sonrası Tedavi ve Takip Fare tamamen uyanık ve aktif olana kadar fare kızılötesi lamba ile ısıtılan kafesteki kurtarmak için izin verin. Daha sonra, normal bir kafes için fareyi hareket ettirin ve su ve gıda ad libitum erişim sağlar. Birfter cerrahisi, düzenli aralıklarla hayvanların izlemek ve iç hayvan bakımı yerel önerisi şu uygun analjezi (örneğin, buprenorfin çözeltisi) ile takip postoperatif tedavi yürütmek ve komiteler kullanın. NOT: 3 gün analjezik tedavi gerçekleştirin. Herhangi bir anormal davranış gibi peritonit, sepsis veya iç kanama gibi komplikasyonlar nadir gösterebilir ve deney sonlandırmak için insan son nokta olarak ele alınmalıdır. Hayvanlar deney sonuna kadar besin ve su ad libitum serbestçe ulaşabildikleri durumda tutulur. Devam eden fibrogenez sarılık ile gösterilir çünkü kan çizim için gerek yoktur. Hayvanlar kurban edildiğinde, kan klinik kimya parametreleri (AST, ALT, bilirubin vb) ve karaciğer histokimyasal ve biyokimyasal analiz için alınır ölçümü için toplanır.

Representative Results

Tipik bir deney Histopatolojik yaklaşık 18-20 gram ağırlığındaki 40 erkek C57BL / 6 vahşi tip farelerde gerçekleştirilmiştir. Bu deney ilerlemesi (10, 14, ve 20 gün) boyunca başlangıç ​​fazı (3 ve 7 gün) karaciğer fibrogenezise, ​​araştırmak için yapılır, ve uzun vadeli (30 ve 60 gün) 16 sırasında oldu. Sürekli deney sonuna kadar artan periportal fibrozit tam 20 gün sonra geliştirilmiştir, ancak bu modelde, persinusoidal fibroz önce, ameliyat sonrası 10. günde geliştirmiştir. Söz konusu deneyde, basit bir sahte operasyon alınan tüm hayvanlar hayatta ve sadece BDL alınan 40 fareden (% 5), iki genel durum kötü gelişmiş ve dolayısıyla erken bir deney planlanan uç noktadan önce kurban edilmişlerdir. BDL tabi hayvanların çoğu ilk üç gün boyunca düşük aktivite gösterirken sahte operasyona hayvanların aktivitesi, istisnasız laparotomi sonra zaten normal bir bir gün oldu. Jaundiced cilt BDL 16 ayarladıktan sonra tüm BDL hayvanlar bir ya da iki gün zaten belirgin olmuştu. karaciğer hasarının köklü serum belirteçlerini ifade ederler, her iki alanin aminotransferaz (ALT) ve aspartat transaminaz (AST) değerler hızlı bir şekilde artan ve BDL (Tablo 1) gün sonra 7 ve 20 gün boyunca yükseldi. Bundan sonra, ALT ve AST güne kadar 30 sürekli bir düşüş ve 60 gün ameliyat sonrasına kadar sabit kalmıştır. Kolestatik yaralanma doğrultusunda, toplam bilirubin serum konsantrasyonları sürekli yüksek ve 7 gün 16 sonra bir platoya ulaşmış. ALT ve AST serum faaliyetlerinin Benzer zaman süreci de BDL uygulanan sıçanlarda bildirildi. Son çalışmada BDL ameliyattan sonraki ilk hafta normal 5 veya 10 kat kadar artmış ve iki hafta sonra 19 azalma serum AST ve ALT düzeylerini gösteren oldu. Tipik olarak, sahte operasyona hayvanların karaciğerleri hala Smoot bakmakDeneyin sonunda h BDL alan hayvanların karaciğer esas karaciğerler ve büyük miktarlarda doldurulur safra kesesi hidropsu karşılık gelen yüzeyi üzerinde ödem ve fibrotik nodüller oluşumu ile karakterize edilen bir mimari değişiklikler gösterirken safra (Şekil 7). BDL cerrahi ile indüklenmektedir karaciğer tipik morfolojik değişiklikler, aynı zamanda standart histolojik analiz (Şekil 8) 'de kanıtlanabilir. Deney aynı sette, karaciğer fibroz gelişimi maksimum vererek, yarı-nicel değerlendirildi periportal fibrozis 0-2 0-4 ve perisinüzoidal fibrozis sahnelendi hangi bir puanlama sistemi kullanılarak bir kör patolog tarafından değerlendirilir karaciğer histolojisi dayalı oldu Beklendiği gibi 6. siroz eşdeğer oldu değer, sahte operasyona hayvanların grubunda ortalama fibrozis skoru 0.00 ± 0.00 idi. T hayvanların grubu içinde aksine,şapka BDL, skor 4.83 ± 0.17 değerine güne kadar 60 sürekli artış aldı. periportal fibrozis için 3 maksimum incelenen tüm hayvanlarda günde 20 ulaşılmıştır, perisinüzoidal fibrozis denemenin ilk 10 gün icerisinde yoktu ve iki hafta sonra öncelikle fark oldu. Bundan sonra, 1.8 ± 0.17 (Tablo 1) değerlerine deneyin sonuna kadar sürekli olarak artmıştır. Ayrıca yapıldı birkaç bağımsız hayvan deneylerinde, bu fibroz oluşumu devam fibrogenez (Şekil 9) bir sonucu olarak, intrahepatik kollajen ifade ve çökelme yüksek oranda çoğaltılabilir gösteren zamana bağlı artış olduğu gözlemlenmiştir. Benzer şekilde, devam eden fibrogenez bir işlem α-düz kas aktini fibroblastik hücrelerin bir markeri eder (α-SMA) yüksek ekspresyonu belirgindir örneğin, yıldız şeklinde hücreler ve portal miyofibroblastlar hepatik aktifve hepatik hidroksiprolin, bol kollajen olarak bulunan bir amino asit 18 (Şekil 9) matrisler. Buna ek olarak, miyofibroblastlar veya fibroblast artan miktarlarda gösterir vimentin ifadesi BDL cerrahisi 20 kurduktan sonra artmıştır. yaralı karaciğer enflamasyonun birlikteliği daha güçlü bir şekilde akut ve kronik karaciğer yaralanması sırasmda ortaya çıkan ve akut karaciğer zedelenmesinde 21,22 sırasında hepato-koruyucu etkiler geliştikçe olan lipokalin 2 (LCN2) artan ifadesi ile yansıtılmaktadır. BDL alan hayvanların karaciğerler infiltre İnflamatuar hücreler CD45 (Şekil 10) için özel olan bir antikor ile belirli bir boyama ile saptanabilir. Ayrıca PTPRC (protein tirozin fosfataz, reseptör tipi) olarak bilinen bu hücre yüzeyi işaretleyicisi özellikle eritrosit ve plazma hücreleri hariç, tüm farklı hematopoietik hücrelerde ifade edilir. <table fo:keep-together.within sayfa = "always" border = "0" cellpadding = "0" cellspacing = "0"> Safra kanalı ligasyonu sonrası Süre (gün) Toplam bilirubin AST (U / L) ALT (U / L) Portal fibrozis Perisinüzoidal fibrozis Toplam skor (Mg / dL) 0 (n = 3) 0.17 ± 0.06 192,67 ± 30.50 50,33 ± 6.03 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 3 (n = 5) 6.85 ± 2.21 1159,25 ± 319,27 566,50 ± 335,25 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 7 (n = 5) <td> 14.38 ± 2.14 ± 976,60 ± 477,16 448,20 ± 259,47 0.60 ± 0.25 0.0 ± 0.0 0.60 ± 0.25 10 (n = 5) 15.92 ± 2.60 1916,60 ± 868,25 560,40 ± 80,88 1.40 ± 0.25 0.25 ± 0.25 1.67 ± 0.25 14 (n = 5) 17.90 ± 3.84 1088,60 ± 276,32 505.00 ± 96,15 ± 2.4 ± 0.25 1.0 ± 0.0 3.40 ± 0.24 20 (n = 4) 18.00 ± 2.12 1072,67 ± 364,27 404,00 ± 195,48 3.0 ± 0.0 1.0 ± 0.0 4.0 ± 0.0 30 (n = 5) 16.04 ± 4.79 446,40 ± 169,75 260,20 ± 126,97 2.8 ±; 0.2 1.4 ± 0.25 4.20 ± 0.20 60 (n = 6) 16.02 ± 1.19 484,67 ± 117,79 257,17 ± 50,97 3.0 ± 0.0 1.8 ± 0.17 4.83 ± 0.17 Kullanılan kısaltmalar şunlardır: ALT, alanin aminotransferaz; AST, aspartat aminotransferaz. Tablo 1: fibrozis bir temsili skorlama bu tablosunun veri karaciğer fibrozu, C57BL / 6 fareleri 16 safra kanalı ligasyonu ile uyarılmış olan bir çalışma yeniden.. Bu çalışmada, BDL ameliyat sonrası ölüm oranı% 5 idi (2 40 hayvanlar erken zavallı hayvan koşulları geliştirilen çünkü kurban edildi). Şekil 1: Bir safra gerçekleştirmek için deneysel kurulumkanal bağlama. Hayvan 37 C arasında bir sıcaklıkta bir ısıtma plakası üzerinde tutulur ve faaliyet alanı sıvı geçirmeyen, kendi kendine yapışan bir örtü ile genel olarak kaplanır. Tam Ameliyat sırasında, hayvan kalıcı olarak anestezi sistemine bağlanır. Tüm Instrumentations ve çözümleri (analjezikler, anestezikler, antiseptik solüsyon,% 0.9 NaCl) açıkça düzenlenmiştir. Şekil 2:. Cerrahi alanının hazırlanması periton boşluğunun önce açılması, karın cilt elektrikli tıraş makinesi ile tıraş kürk ve antiseptik gazlı bez ile dezenfekte edilmelidir. Cerrahi bölge daha sonra sıvı geçirmeyen, kendi kendine yapışan bir örtü ile kaplıdır. Karın orta hat laparotomi (~ uzunluğunda 2 cm) ile açılır. kavite sternum bir holding sütür ve yayılan operasyon alanını ekleyerek büyütülürAmeliyat sırasında engelsiz deney sağlayan bir Colibri retraktör sokulması. Şekil 3: safra kanalı Poz. Bu diyaframa sopa ve hepatik hilus açıkça görünür hale böylece safra kanalı ligasyonu iletken için (A), karaciğer ventral tarafı kaldırdı. (B) daha iyi safra kanalı göstermek için, bağırsak kaudal ile taşınır Bir nemlendirilmiş pamuklu çubukla. safra kanalı bir okla işaretlenmiştir. Şekil 4: safra kanalı bağlanması. (A), bir birinci adımda, safra kanalı, bir mikro-Çentikli forseps kullanılarak portal damar ve hepatik arter yan dikkatlice ayrılır. (B) daha sonra, bir ameliyat dikiş ipliği etrafına yerleştirilirsafra kanalı ve bir cerrahi düğüm ile tespit edilmiş. (c) Bundan sonra, ikinci bir ameliyat dikiş ipliği, ilk dikiş yakın yerleştirilmiş ve safra kanalı çevresinde düğümlenir. (D), ameliyat dikiş ipliği kısaltılmaktadır, boşluk% 0.9 NaCl çözeltisi ile durulandı ve bütün organları kendi fizyolojik konumuna yerini aldı. Şekil 5:.. Ile safra kanalı Düğümleme hassas temsil sütür yerleştirme ve safra akışını önlemek iki knot ayarını belgelemek için, Şekil 4'te belirtilen aynı prosedür binoküler altında belgelenmiştir (A) Confinement İlk dikiş. İlk dikiş (B) Düğüm. İkinci sütür ile safra kanalının (C) Confinement. (D) ikinci dikiş Düğüm. (E) safra d Çift ligelerine aşırı sütür kısaltılması sonra. (E ') Bu panel (E) bir kroki göstermektedir. sağa sola (rl), (II) ve orta (mi) lob karaciğer gibi safra kanalı, mide ve oniki parmak bağırsağı pozisyonlarını harflerle edilir. Kroki safra kanalı çift iki sütür ile bağlanır. Şekil 6:. Safra kanalı, portal ven ve farelerde hepatik arter anatomisi koledok daha iyi anatomik konumu için, portal ven ve hepatik arter bir şema olarak tasvir edilir. İşaretli da sağ (rl) pozisyonlarıdır, sol (II) medyan (mi) ve karaciğer kaudat (Cl) loblar. Şekil 7: Temsilci appeara2 hafta Sham ve BDL sonrası karaciğer ım. C57BL / 6 fareleri işlem veya BDL cerrahi Sham tabi tutuldu. İki hafta sonra, organ boşluğu açıldı. Sahte operasyona hayvanların karaciğerleri fibrozis belirtisi gösterirken, safra kanalı ligasyonu alan hayvanların karaciğerleri gelen karaciğer yüzeyinde ödem oluşumu ve fibrotik nodüller ile düzensiz bir yüzey yapısı vardı. Şekil 8:. Hematoksilin ve eozin boyama, karaciğer kesitleri (A) 'numaradan ameliyat edilmişlerdir ya da üç hafta sonra (B) için BDL alınan, C57BL / 6 vahşi tip hayvanlardan meydana getirilmiştir. bölümler hematoksilin ve eozin aşağıdaki standart prosedürler ile boyandı. Inflamasyon belirtileri (infiltre hücreler), parankimal (Hepato dahil BDL karaciğer içinde tipik değişiklikleri unutmayıncyte) nekroz ve safra kanallarının çoğalması. Her şekil panelinde ölçek çubuğu 50 mikron temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 9: hepatik fibrogenez için histolojik ve biyokimyasal okumalar. (A), karaciğer kesitleri 2 hafta boyunca plasebo işlemi veya BDL almış olan hayvanlarda, hazırlandı ve Sirius Kırmızı (üst panel, kırmızı kollajen lifleri) ile boyandı ya da α-düz kas aktini sentezlenmesi (α-SMA) (alt panel için analiz edildi immünohistokimyasal olarak kahverengi, α-SMA pozitif hücreler). Her bir şekil panelinde ölçek çubuğu 100 um temsil eder. (B), karaciğerinden alınan protein ekstreleri, Western blot tabi tutulur ve Expre bakımından analiz edilmiştirkollajen tip I, α-SMA ve iyi hepatik fibrogenez belirteçleri kurulan Vimentinin salgılanması. lipokalin-2 (LCN2) olarak ifade eden fibrogenez ile ilişkili inflamatuar yanıtı göstermektedir. Bu analizde, eşit protein yükleme β-aktin için özel bir antikor ile lekelerini araştırarak gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 10:. Infiltre olan inflamatuar hücrelerin immünolojik boyama Seri karaciğer dokularında 3 hafta içinde safra kanalı ligasyonu alınan bir hayvan karaciğer hazırlandı. bölümleri hematoksilin ve eozin (A) ya da CD45 (B) için özel olan bir antikor ile boyandı. Lütfen aklınızda bulundurun,safra kanalları çevreleyen CD45 pozitif hücrelerin sayısının yüksek. Iltihaba sebep Bu büyük sızıntılar yapay olarak ameliyat edilmiş hayvanlardan elde edilen karaciğer parçalarında görünmez (gösterilmemiştir). Her şekil panelinde ölçek çubuğu 500 mikron temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Kolestatik karaciğer hasarı, kronik karaciğer hastalığı olan hastalarda karaciğer fibroz ve siroz gelişmesi için temel nedensel faktörlerin biri. Bu hastalıklar ölçülemez sağlık masraflarını üretmek gerçeğine dayanarak, birçok araştırmacı devam eden hepatik fibroz patojenik mekanizmalarını anlamak için çalışıyoruz anlaşılabilir. Bu nedenle, deneysel modeller karaciğer iltihabı, fibrozis ve siroza yol açan karmaşık 1 mekanizmaların çeşitli yönlerini taklit oluşturulan edilmiştir.

Cerrahi BDL farelerde ve sıçanlarda 4,23,24 obstrüktif kolestatik hasara yol için kullanılan en yaygın deney modellerinde biridir. Protokoller çoğunda, hayvanlar anestezi edilmekte ve Orta bölüm laparotomi gerçekleştirilir. Daha sonra, safra kanalı karın boşluğundan ortaya ve cerrahi sicim kullanılarak iki kez bağlandı. Sonuç olarak, fareler ve sıçanlar bu ameliyat d aldığınıevelop ilk periportal alanlarda 25 kaynaklanan güçlü bir fibrotik reaksiyon. Yıllarda çeşitli cerrahi teknikler ve modifikasyonlar tarif edilmiştir. Özel prosedürler bile BDL 23 sonra yeniden bağlanma ya da re-anastomoz sağlar. Diğer teknikler, önemli ölçüde daha az nekroz oluşumu ve bunun sonucu olarak, hepatosit proliferasyonu 24 elde edilen kısmi BDL dayanmaktadır. Kolesistit oluşumunu önler safra kesesi (kolesistektomi) sonradan giderilmesi ile birlikte Kısmi BDL akut kolestaz için mükemmel bir deneysel model temsil eder. İnsan durumun 24 yakın bir model olduğu ileri sürülmüştür. Ve gerçekten de, bu modelin kurulması sırasında, o zaten tekrarlanabilir sadece minimal histolojik doku hasarı ile kolestaz nedenleri ve kronik kolestaz 25 devam etmediğini ortaya konmuştur. Bu nedenle, bu model enlem çalışmak için ideal olduğu öne sürülmüştürters kolestaz 24 e etkileri. Hatta daha sofistike yöntemler mikrocerrahi dayalı ve hızlı ve tekrarlanabilir bir yol sadece karaciğer 26 seçilmiş bölgelerinde kolestatik karaciğer hasarı indirebilmek için izin vardır.

Orijinal BDL protokolü bu sofistike modifikasyonlar özel araştırma soruları araştıran çok yararlı kanıtlanmış olmasına rağmen, birçok laboratuvarda dünya çapında temelde kolestatik karaciğer fibrozis için son derece güvenilir ve tekrarlanabilir model olarak BDL modeli istihdam hedefliyoruz. Ancak, birçok komplikasyonlar büyük ölçüde teknik yanlışlıklar kaçınılmalıdır değilse, bu modelle elde edilen sonuçların tekrarlanabilirliği ve güvenilirliği değiştirebilir ki oluşabilir. Sırasında ya da hızla ameliyat sonrası oluşabilecek – Örneğin, safra kanalı eşlik kan damarlarının yaralanması ile ilgili kanama komplikasyonları (4 Şekil 3). Sonraki kardiyodepresyona veya r anestezi doz aşımıespiratory yetmezliği de prosedürün önlenebilir komplikasyonlar vardır. Dikişler doğru periton boşluğuna yapılan ve safra kaçağı değilse peritonit gelen sepsis kadar Şiddetli enfeksiyonlar, deney tüm döneminde ortaya çıkabilir. Ameliyat sırasında bağırsak Kaza yaralanmaları da peritonit yol açabilir. Bu nedenle, bu sıkı kullanım kurallarına uygun olan standart protokolleri kuvvetle gerekli olduğu açıktır. Bu koşul yakın zamanda 2013 1 yeni hayvan refahı kuralları uygulamaya Avrupa Birliği, ülkeleri içinde talep edildi. Bu yönetmelik ile ilişkili ilgili şartlar yeni değildir ve zaten 1959 yılında önerilmiştir, Russell ve Burch etik önerdi ağırlıklı olarak yerine, arıtma ve azaltma (3R) prensibine 27 dayanmaktadır hayvanlarla bilimsel deneyler için çerçeve.

Outlin izlerkened protokolü teknik yanlışlıklar doğabilecek sadece birkaç komplikasyonlar vardır. Üç özel sorunlar oldukça düşük frekansta oluşabilir.

Tüm cerrahi işlemlerde olduğu gibi, anestezik aşırı dozda özellikle hipotermi ile birlikte hayvanlara tehlike potansiyel kaynağıdır. Ameliyat sırasında kardiyovasküler komplikasyonlar ortaya çıkarsa, anestezik arz derhal durdurulmalı ve operatör fare mümkün oksijen gibi çok sağlamak için çalışmalısınız. Bu hava ile dolu ve bozulmuş hayvanın ağzına pompalanır küçük bir plastik şırınga vasıtasıyla yapılabilir. Alternatif olarak, etkilenen hayvan havalandırma için küçük bir Peleusball kullanımı canlandırılması süreci için sık sık yararlı olduğunu.

Yara iyileşmesinde Sorunlar

BDL Ameliyattan sonra, fareler kendi boğaz dikişler veya diğer hayvanların bu ısırabilir. Bu durum ortaya çıkarsa, ilgili fareler ayrı olmalıKafesli. Açık yara olan hayvanlar yara etrafında bölge yavaşça bir standart antiseptik ile sterilize ve yara tekrar dikilmelidir, anestezi gerekir. Önümüzdeki 3 gün boyunca, bu hayvanların yara düzenli (2-3 kez bir gün) kontrol edilmelidir.

Karın veya asit oluşumu Distensions bakteriyel enfeksiyonlar için göstergesidir. Bunlar nedeniyle ameliyat sırasında steril olmayan çalışma oluşabilir. Enfeksiyonların her türlü insani son nokta olarak istisnasız ele alınmalıdır ve etkilenen hayvanlar kurban edilmelidir.

Biz kolay uygulamak basit ve yüksek tekrarlanabilirlik ile birlikte sadece düşük hayvansal mortalite çağrıştırıyor farelerde BDL performansını sağlayan protokolü takip sağladı. Cerrahi protokollerin tüm hızla yetenekli bilim adamları tarafından yakalanan olabilir. Tam deney sırasında, hayvanlar 37 ° C 'de bir sıcak tutma levhasının üzerinde tutuldu ve sürekli bağlıdırBir anestezi sistemine ağrı ve sıkıntı en aza indirir. Ameliyat için, karın orta hat laparotomi ve diseksiyon olmadan çift bağlandı safra kanalı açıldı. Burada ele alındı ​​temsilcisi sonuçları karaciğer morfolojisi (inflamasyon, fibrozis, siroz) açısından fenotipik değişiklikler son derece tekrarlanabilir ve fibrogenez farklı yönlerini incelemek için izin olduğunu göstermek (örn., inisiyasyon, inflamasyon, ilerlemesi, son dönem hastalığı) belirlenen zaman noktalarında.

Biz bizim protokol özeti başarıyla diğer laboratuarlarda bu fibrozis modeli kurmak ve farklı yerlerde güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçları garanti için gerekli olan öğrenme eğrisi kısaltmak için yardımcı olacağını umuyoruz. Böylece biz sunulan protokol 1959 yılında Russell ve Burch tarafından gerekiyordu 3R prensibini destekler ve halen pek çok ülkede wi uygulanan yeni hayvan refahı kuralları temelini temsil ettiğini düşünüyorumİnce Avrupa Çerçeve.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Alman Araştırma Vakfı (SFB / TRR57, Q3 ve Q2) mali destek kabul etmek istiyorum. Yazarlar fotoğraf hazırlarken onların yardım için Mareike Schulz, Pascal Paschenda ve Klaudia Warzecha teşekkür ederiz.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Isoflurane Forene Abbott B 506
Shaver Favorita II Aeskulap GT104
Cutter head Aeskulap GT730
Bepanthen eye and nose ointment Bayer Vital GmbH 6029009.00.00
Warming plate and controller Labotect HP 062
Fluovac anesthesia system Harvard Apparatus 34-1030
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser Eickemeyer 4802885
Scotch Tape commercially available
Tissue paper commercially available
Durapore silk tape 3M 1538-1
Cotton Gauze swabs Fuhrmann GmbH 32014
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum Antiseptica GmbH 72PAH200
Raucodrape OR adhesive drapes Lohmann & Rauscher GmbH 33013
Scissor Fine Science Tools Inc. 14074-11
Graefe forceps straight Fine Science Tools Inc. 11050-10
6-0 Mersilk suture Ethicon K889H Silk, non-absorbable/Abdominal closure
Needle holder Mathieu Fine Science Tools Inc. 12010-14
Colibri retractor Fine Science Tools Inc. 17000-03
Cotton swabs Noba Verbandmittel 974202
Cotton swabs Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH 1032238
25mL beaker Schott Duran 50-1150
Isotonic (0.9%) NaCl solution DeltaSelect GmbH PZN 00765145
Micro-serrations forceps Moria MC31 Fine Science Tools Inc. 11370-31 Bile duct separation
5-0 Mersilene suture Ethicon EH6731H Polyester, non-absorbable/Bile duct ligation
5mL syringe BD Discardit II 300296
1mL syringe BD Plastipak 300013
Sterican needle 26 G x 1 B. Braun 4657683
Buprenorphine Essex Pharma 997.00.00 Analgeticum, 0.1 mg/kg
Infrared lamp Petra Electric IR 11
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Liedtke, C., et al. Experimental liver fibrosis research: update on animal models, legal issues and translational aspects. Fibrogenesis Tissue Repair. 6 (1), 19 (2013).
  2. Aller, M. A., Arias, J. L., García-Domínguez, J., Arias, J. I., Durán, M., Arias, J. Experimental obstructive cholestasis: the wound-like inflammatory liver response. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 6 (2008).
  3. Tacke, F., Weiskirchen, R. Update on hepatic stellate cells: pathogenic role in liver fibrosis and novel isolation techniques. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 67-80 (2012).
  4. Weiler-Normann, C., Herkel, J., Lohse, A. W. Mouse models of liver fibrosis. Z. Gastroenterol. 45 (1), 43-50 (2007).
  5. Cameron, G. R., Oakley, C. L. Ligation of the common bile duct. J. Pathol. 35 (5), 769-798 (1932).
  6. Cameron, G. R., Hasan, S. M. Disturbances of structure and function in the liver as the result of biliary obstruction. J. Pathol. 75 (2), 333-349 (1958).
  7. Accatino, L., Contreras, A., Fernańdez, S., Quintana, C. The effect of complete biliary obstruction on bile flow and bile acid excretion: postcholestatic choleresis in the rat. J Lab Clin Med. 93 (5), 706-717 (1979).
  8. Accatino, L., Contreras, A., Berdichevsky, E., Quintana, C. The effect of complete biliary obstruction on bile secretion. Studies on the mechanisms of postcholestatic choleresis in the rat. J Lab Clin Med. 97 (4), 525-534 (1981).
  9. Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
  10. Tuchweber, B., Desmoulière, A., Bochaton-Piallat, M. L., Rubbia-Brandt, L., Gabbiani, G. Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 74 (1), 265-278 (1996).
  11. Desmoulière, A., et al. Extracellular matrix deposition, lysyl oxidase expression, and myofibroblastic differentiation during the initial stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 76 (6), 765-778 (1997).
  12. Arias, M., et al. Adenoviral expression of a transforming growth factor-β1 antisense mRNA is effective in preventing liver fibrosis in bile-duct ligated rats. BMC Gastroenterol. 3 (29), (2003).
  13. Borkham-Kamphorst, E., et al. Dominant-negative soluble PDGF-β receptor inhibits hepatic stellate cell activation and attenuates liver fibrosis. Lab. Invest. 84 (6), 766-777 (2004).
  14. Borkham-Kamphorst, E., Huss, S., Van de Leur, E., Haas, U., Weiskirchen, R. Adenoviral CCN3/NOV gene transfer fails to mitigate liver fibrosis in an experimental bile duct ligation model because of hepatocyte apoptosis. Liver Int. 32 (9), 1342-1353 (2012).
  15. Borkham-Kamphorst, E., et al. The anti-fibrotic effects of CCN1/CYR61 in primary portal myofibroblasts are mediated through induction of reactive oxygen species resulting in cellular senescence, apoptosis and attenuated TGF-β signaling. Biochim. Biophys. Acta. 1843 (5), 902-914 (2014).
  16. Huss, S., et al. Development and evaluation of an open source Delphi-based software for morphometric quantification of liver fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 3 (1), 10 (2010).
  17. Borkham-Kamphorst, E., Drews, F., Weiskirchen, R. Induction of lipocalin-2 expression in acute and chronic experimental liver injury moderated by pro-inflammatory cytokines interleukin-1β through nuclear factor-κB activation. Liver Int. 31 (5), 656-665 (2011).
  18. Karlmark, K. R., et al. The fractalkine receptor CX3CR1 protects against liver fibrosis by controlling differentiation and survival of infiltrating hepatic monocytes. Hepatology. 52 (5), 1769-1782 (2010).
  19. Tarcin, O., et al. Time course of collagen peak in bile duct-ligated rats. BMC Gastroenterol. 11, 45 (2011).
  20. Takase, S., Leo, M. A., Nouchi, T., Lieber, C. S. Desmin distinguishes cultured fat-storing cells from myofibroblasts, smooth muscle cells and fibroblasts in the rat. J. Hepatol. 6 (3), 267-276 (1988).
  21. Borkham-Kamphorst, E., et al. Protective effects of lipocalin-2 (LCN2) in acute liver injury suggest a novel function in liver homeostasis. Biochim. Biophys. Acta. 1832 (5), 660-673 (2013).
  22. Labbus, K., et al. Proteomic profiling in Lipocalin 2 deficient mice under normal and inflammatory conditions. J Proteomics. 78, 188-196 (2013).
  23. Kirkland, J. G., et al. Reversible surgical model of biliary inflammation and obstructive jaundice in mice. J. Surg. Res. 164 (2), 221-227 (2010).
  24. Heinrich, S., et al. Partial bile duct ligation in mice: a novel model of acute cholestasis. Surgery. 149 (3), 445-451 (2011).
  25. Scholten, D., et al. Genetic labeling does not detect epithelial-to-mesenchymal transition of cholangiocytes in liver fibrosis in mice. Gastroenterology. 139 (3), 987-998 (2010).
  26. Aller, M. A., et al. A half century (1961-2011) of applying microsurgery to experimental liver research. World J Hepatol. 4 (7), 199-208 (2012).
  27. Russell, W. M. S., Burch, R. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).

Tags

Bile Duct LigationMiceCholestasisLiver InjuryLiver FibrosisObstructive CholestasisBile Flow ObstructionSurgical TechniqueAnimal Model

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Weiskirchen, S., Borkham-Kamphorst, E., Tolba, R. H., Tacke, F., Weiskirchen, R. Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis. J. Vis. Exp. (96), e52438, doi:10.3791/52438 (2015).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image