胆管结扎小鼠：感应炎性肝损伤和纤维化的阻塞性胆汁淤积

在一个典型的实验BDL在40雄性C57BL / 6野生型小鼠加权约18-20克执行。这个实验是为了研究肝纤维化，在起始阶段（3和7天），进展（10，14，和20天）期间和长期（30和60天）16中。在这种模式下，persinusoidal纤维化已经在手术后10天的发展，而门静脉周围纤维化是永久增大至实验结束后20天被充分开发。在所提到的实验中，所有接收到的一个简单的假手术的动物存活，而只有两个40只小鼠（5％），该接收到的BDL的开发了一般状况较差，并因此在实验计划结束点之前过早处死。假手术动物的活性是无一例外已经正常1天剖腹后，在最初三天而大部分经受BDL动物表现出降低的活性。 Ĵaundiced皮肤有BDL 16的设定后，已经已经很明显在所有BDL动物一两天。 两个谷丙转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST），代表肝损伤的行之有效的血清标志物的值迅速增加和BDL（见表1）后，在第​​7天和第20天达到高峰。此后，ALT和AST持续下降，直到第30天，并保持稳定，直到手术后60天。与胆汁淤积损伤线，总胆红素血清浓度升高逐渐达到7天后16高原。对ALT和AST血清的活动类似的时间当然也报道了老鼠进行BDL。在最近的研究中它被证明血清AST和ALT水平升高达5或10倍的正常的第一周BDL手术后两周19后下降。 通常情况下，假手术的动物的肝脏仍然期待斯穆特H在实验结束时，而接收BDL动物的肝脏中显示的架构改变其主要特征在于水肿和纤维化结节的形成对应的肝和胆囊的填充有大量积水的表面上胆（ 图7）。特性形态学改变肝脏了由BDL手术诱导也可证明在标准的组织学分析（ 图8）。 在同一组实验中，肝纤维化的发展是基于肝脏组织学通过使用评分系统，其中门静脉周围纤维化是从0-4和窦周纤维化上演0-2盲病理学家评估半定量评估，得到最大值，该值相当于6.肝硬化正如预期的，平均纤维化评分的组假手术的动物中为0.00±0.00。与此相反，该组的动物吨帽子收到BDL，比分稳步上升，直到60天至4.83±0.17的数值。的3对门脉周围纤维化的最大值在20天达到在分析的所有动物中，窦周纤维化是在第10天的实验的缺席，是先显后两周。此后，它逐渐增大至实验结束，以1.8±0.17（ 表1）的值。 另外，在已执行的其他几个独立的动物实验中，观察到纤维化的形成是肝内胶原表达和沉积的高度重现放映时间依赖性增加正在进行纤维化（ 图9）的结果。同样地，正在进行纤维化的过程是显着的升高的表达α平滑肌肌动蛋白（α-SMA），表示成纤维细胞的标记， 即活化的肝星状细胞和成肌纤维细胞的门户，和肝脏中羟脯氨酸的氨基酸在胶原丰富地发现矩阵18（ 图9）。此外，波形蛋白是表示增加肌纤维母细胞或成纤维细胞的数量表达的BDL手术20的设定后增加。炎症在受伤的肝脏通过相伴2脂质运载蛋白（LCN2）是急性和慢性肝损伤强烈诱导和演进过程中的急性肝损伤21,22保肝作用的表达增加，进一步体现。 可以通过特异性染色的抗体，其特异于CD45（ 图10）检测到的炎性细胞浸润所接收BDL动物的肝脏。这种细胞表面标记物也被称为PTPRC（蛋白质酪氨酸磷酸酶，受体型）是在所有的分化的造血细胞，除了红细胞和血浆细胞中特异性表达。 <table fo:keep-together.within页="“总是”边界=“0”的cellpadding" > 胆管结扎后时间（天） 总胆红素 AST（U / L） ALT（U / L） 门户纤维化 窦周纤维化 总比分 （毫克/ dL）的 0（N = 3） 0.17±0.06 192.67±30.50 50.33±6.03 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 3（N = 5） 6.85±2.21 1159.25±319.27 566.50±335.25 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 7（N = 5） <td> 14.38±2.14± 976.60±477.16 448.20±259.47 0.60±0.25 0.0±0.0 0.60±0.25 10（N = 5） 15.92±2.60 1916.60±868.25 560.40±80.88 1.40±0.25 0.25±0.25 1.67±0.25 14（N = 5） 17.90±3.84 1088.60±276.32 505.00±96.15± 2.4±0.25 1.0±0.0 3.40±0.24 20（N = 4） 18.00±2.12 1072.67±364.27 404.00±195.48 3.0±0.0 1.0±0.0 4.0±0.0 30（N = 5） 16.04±4.79 446.40±169.75 260.20±126.97 2.8±; 0.2 1.4±0.25 4.20±0.20 60（6） 16.02±1.19 484.67±117.79 257.17±50.97 3.0±0.0 1.8±0.17 4.83±0.17 使用缩写是：ALT，谷丙转氨酶; AST，天冬氨酸转氨酶。 表1：纤维化得分在一个代表性实验该表的数据是从在其中肝纤维化是在C57BL / 6小鼠16诱导胆管结扎研究再现。在这项研究中，死亡率的BDL手术后为5％（2 40只动物处死过早因为差的动物条件开发）。 图1：实验装置用于执行胆管结扎的动物保持在加热板上，在37℃的温度和操作区域覆盖整体与不透液性，自粘窗帘。在完成手术后，动物被永久地连接到一个麻醉系统。所有仪器及解决方案（镇痛药，麻醉剂，消毒液，0.9％氯化钠）排列清晰。 图2：手术区的制备腹腔开放前，腹部皮肤，应剃光用电动剃须刀的皮毛和消毒与杀菌纱布拭。该手术区域，再覆盖不透液性，自粘窗帘。腹部被打开了中线剖腹手术（〜2厘米长）。该空腔是通过将在胸骨的保持缝线和操作区域散布的放大插入科利柏牵引器允许在手术过程中不受阻碍地实验。 图3：曝光胆管。 （A）为进行胆管结扎，肝脏的腹侧被抬起，以便它可以粘到隔膜和肝门变得清晰可见。（B）中为了更好地暴露胆管，食道被尾侧移动了与一个加湿棉签。胆管是用箭头标记。 图4：结扎胆管。 （A）在第一步骤中，胆管小心地从使用微锯齿镊子侧翼门静脉和肝动脉分开。（B）接着，缝合线周围放置胆管和固定用外科结。（℃）之后，将第二缝合线放置在靠近第一缝合线和周围的胆管癌打结。（D）中的缝合线被缩短，腔冲洗用0.9％NaCl溶液和所有器官来代替他们的生理位置。 图5：胆管与打结的精确表示要记录的放置缝合线和两个结防止胆汁流的设定，在图4中所概述的相同的程序下双目是记录（A）的约束第一缝合线。在第一缝线的（B）中打结。胆管与第二缝合的（C）的约束。（D）的所述第二缝线打结。（E） -双结扎胆汁ðUCT后缩短多余缝线。（E'），此面板描绘了（E）的草图。肝脏的右侧（RL），左（LL）和中值（毫升）裂片以及胆管，胃，十二指肠和所述位置字母。在草图胆管由两个双缝线结扎。 图6：胆管，门静脉和肝动脉小鼠解剖对于胆总管更好解剖位置，门静脉和肝动脉被描述为一个方案。标示也右侧（RL）的位置，左（LL）中位数（毫升）和肝脏的尾状（CL）瓣。 图7：代表appearaNCE肝脏术后2周假手术组和BDL的。的C57BL / 6小鼠进行假手术或BDL手术。两周后的内脏腔被打开了。而假手术动物的肝脏显示纤维化的迹象，动物接受胆管结扎的肝脏对应肝脏的表面上有一个不规则的表面结构，形成水肿和纤维化结节。 图8：HE染色染色肝切片从C57BL / 6野生型动物，是假手术（A）或接收BDL三周（B）制备的。将切片用苏木精和曙红下列标准程序。请注意，BDL肝脏内的典型的改变，包括炎症的迹象（浸润细胞），实质（肝CYTE）坏死，胆管增生。在每幅图板比例尺条为50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。 图9：组织学和生物化学读数为肝纤维化。 （A）的肝脏切片从该接收的假手术或BDL 2周的动物制备并用天狼星红（ 上面板，在红色的胶原纤维 ），或为α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达（ 下图进行分析，α-SMA棕色阳性细胞 ）免疫组化法。在各图面板的比例尺条为100μm左右。（B）中 ，从肝脏的蛋白质提取物进行Western印迹和expre分析裂变I型胶原，α-SMA，波形蛋白和被公认的肝纤维化的标志物。脂笼蛋白-2（LCN2）的表达指示与正在进行的纤维形成相关的炎症反应。在这种分析中，平等的蛋白质负荷证明了探测印迹特定的β肌动蛋白的抗体。 请点击此处查看该图的放大版本。 图10：浸润炎症细胞的免疫学染色串行肝脏切片从该接收到的胆管结扎3周的动物的肝脏制备。将切片用苏木精和曙红（A）或与一种抗体，其特异于CD45（B）中 。请注意，高数周围胆管的CD45阳性细胞。 （未示出），这些大规模浸润，表明炎症不在从假手术动物的肝脏切片可见。在每幅图板比例尺条为500微米。 请点击此处查看该图的放大版本。