El cultivo de<em> Heligmosomoides polygyrus:</em> Un inmunomodulador nematodo parásito y sus productos secretados

NOTA: Todos los procedimientos de este protocolo se realiza de acuerdo con las directrices establecidas por el Reino Interior del Reino y de la Universidad de los Servicios Veterinarios de Edimburgo. 1. La infección de ratones por sonda Tienda Heligmosomoides polygyrus L3 larvas en agua destilada durante un máximo de seis meses a 4 ° C. Antes de su uso, lavar larvas L3 tres veces en agua destilada: centrifugar a 300 xg durante 10 min (con freno), pero eliminar todos los 500 l de agua (para evitar larvas L3 granulado perturbador) y resuspender el pellet cada vez. Para el tercer lavado, añadir agua a un volumen exacto (típicamente 40 ml) y aspirado de 20 l con un corte de punta de 200 l para ampliar su abertura. Coloque dos 20 muestras mu l sobre la superficie de una placa de cultivo de 60 mm y contar las larvas L3 (generalmente móvil, y el mejor se observa bajo magnificación 50X con un microscopio de disección). Resuspender el sedimento final en agua destilada a una concentration de 2.000 L3 larvas por ml. Para la producción del ciclo de vida, infectar F1 (C57BL / 6xCBA) ratones 8 semanas de edad con 400 H. larvas L3 polygyrus en 200 l de agua destilada por sonda oral (restringir ratones en la posición vertical por la piel del cuello y pasar suavemente la aguja de sonda roma a través de la boca y el esófago hasta el estómago). Agitar bien antes de cada infección (larvas depositan rápidamente en agua) y aspirado de 200 l en una jeringa de 1 ml; utilizar una aguja de sonda dedicado con un extremo redondeado. Para la infección experimental de ratones más jóvenes (6-8 semanas de edad), o de otras cepas puras (por ejemplo, C57BL / 6 o BALBc), infectar a los ratones con 200 larvas L3. 2. Propagación y Mantenimiento de H. polygyrus Coloque el carbón en el centro de una gran tina de plástico y deje que el agua fría del grifo corra sobre ella durante un mínimo de 30 min (carbón activado sin lavar es tóxico para las larvas L3). Escurrir el agua de la bañera y colocar el carbón de leña en two capas de papel absorbente, dejándolo expuesto al aire ambiente hasta que esté completamente seco. Si se necesitan huevos, raspar heces primero fuera del colon con pinzas y tijeras (si es necesario). Si se necesita un gran número de larvas L3, colocar los ratones en una rejilla de alambre y recoger bolitas fecales durante varios días. Mezclar las heces con carbón granulado en una proporción de al menos un 1: 1, para lograr una consistencia humedad suficiente para adherirse a papel de filtro. Unte una capa delgada en el centro de un poco de papel de filtro humedecido en una placa de Petri y colocar esto en una caja húmeda (añadir un poco de toalla de papel húmeda y un plato de agua) en la oscuridad durante 12-14 días. Eliminar larvas L3 de día 7 en adelante, y recogerlas en al menos dos ocasiones antes se descarta el papel. Las larvas forman un anillo alrededor del borde del papel de filtro; levantar el papel de filtro fuera de la placa de Petri y enjuagar las larvas que quedaron de la placa (utilizando una pipeta y 5 ml de agua estéril por placa) en un tubo de 50 ml. Ascensoren el papel de filtro y la cosecha de las larvas restante dejado en el plato con agua destilada en un tubo de 50 ml. Centrifugar la solución efluente a 300 xg durante 10 min. Lavar las larvas tres veces con agua destilada y luego se almacena a 4 ° C en un máximo de 50 ml de agua destilada hasta que se requiera. NOTA: Las larvas permanecen viables e infecciosos durante al menos 6 meses. 3. Recolección de Adultos H. polygyrus Worms Preparar el aparato de Baermann modificado de antemano como se muestra en la Figura 1. Ratones Cull Catorce días después de la infección. Lavar el abdomen con etanol al 70%. Cortar la piel sobre el abdomen y tire hacia atrás para revelar la pared abdominal anterior. Haga incisión media para entrar en la cavidad peritoneal. Eliminar todo el intestino delgado y grueso (de duodeno proximal al recto distal). Coloque en un plato de Petri seco. Enderezar el intestino a lo largo de toda su longitud; extirpar el colon heces que contienen; colocar esto en un plato aparte para los preparados de huevo posteriores. Escindir el proximales 20 cm de intestino delgado que contiene los gusanos adultos, identificados por la pared relativamente gruesa del duodeno y con frecuencia una apariencia de color rojo debido a los gusanos intra-luminal. Colocar en una (100 mm de diámetro) placa de Petri con 5 ml de solución de Hanks, se calentó a 37 ° C (dos especímenes por plato). Abra la porción proximal del intestino gusano lleno longitudinalmente con tijeras (tijeras ronda terminado son los mejores para esto), y raspar el interior del intestino forro con dos láminas de vidrio para eliminar los gusanos. Luego deseche la pared del tubo digestivo limpio. Gusanos punta en pequeñas bolsas de muselina, grapa cerradas y seguras con clips alrededor del borde del embudo de vidrio (Figura 1). Llenar el embudo con la solución de Hanks y añadir aproximadamente 4 placas de Petri de gusanos en cada embudo. Coloque el aparato en incubadora a 37ºC durante 1-2 horas, agitando suavemente a medio camino para desalojarresiduos de la preparación intestinal que puede ocluir el filtro de muselina. Tenga cuidado para evitar vertidos de escombros fuera de la bolsa de muselina – esto hará que la contaminación de la preparación final HES. Los gusanos adultos deberían haber emigrado lentamente a través de la tela de muselina y se instaló en la parte inferior del tubo de ensayo de vidrio. Cuidadosamente separe el tubo de ensayo de la manguera de caucho de conexión sobre el fregadero (teniendo cuidado de evitar la pérdida de gusanos en este punto). Con una pipeta de plástico, transferir los gusanos en un tubo de 50 ml y lavar seis veces con Hanks 'solución (permiten gusanos se asienten con la gravedad, extraiga el soporte con un stripette, agregar 40 ml de Hanks' solución y repita cinco veces). NOTA: lombricultura debe mantenerse estéril desde este punto en adelante. Mover a una campana de flujo laminar y lavar otras seis veces en solución estéril de Hank suplementado con 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina, listo para el cultivo in vitro. Cuente elgusanos adultos recuperados por la toma de dos muestras de 20 l tomadas con un corte de punta amarilla para ampliar su apertura; esperar que aproximadamente el 50% de la cantidad de larvas inoculado. 4. Configuración de las Culturas de HES: Preparación mediana, Lavado gusanos adultos Remojar los gusanos de 3,11 en aproximadamente 10 ml de RPMI suplementado con 10% de gentamicina durante 20 min, dejando el tubo de reposo en un ángulo para asegurar gusanos están completamente cubiertos. Realice esto en una campana de flujo laminar: lavar de nuevo seis veces con solución de Hanks (suplementado con 5 U / ml de penicilina y 5 mg / ml de estreptomicina). Preparar H. medios polygrus. El mantenimiento de la esterilidad en una campana de flujo laminar, a 500 ml de RPMI1640, añadir 11,1 ml de 45% de glucosa (concentración final 1,2% como RPMI1640 contiene 0,2% de glucosa), 5 ml de 100x Peniclllin-estreptomicina (concentración final 5 U / ml de penicilina, 5 mg / ml de estreptomicina), 5 ml de L-glutamina (concentración final 2 mM), y5 ml de Gentamicina (concentración final 1%). No agregue FCS. Gusanos alícuotas en frascos T25 ventilados, aprox. 1.000 gusanos en 15 ml H. polygyrus medios de comunicación por matraz, y el lugar en posición vertical en 37 ° C incubadora (5% CO 2) durante 3 semanas. 5. Preparación de HES Recoger HES contienen medios de cultivo a partir de cultivos a intervalos de no más de dos veces por semana, dejando de lado la primera colección después de 24 horas de cultivo (debido a los altos niveles de contaminación por LPS y proteínas del huésped – se puede procesar por separado o se descarta). Mantenga cada recogida selectiva y claramente etiquetado con la fecha y número de lote. Reemplace con un volumen igual de H. polygyrus medios en cada ocasión. Centrifugar HES que contiene el medio a 400 x g durante 5 min. Luego filtrar esterilizar a través de 0,2 micras filtros baja en proteínas de unión en tubos de 50 ml. Conservar en el congelador a -20ºC claramente etiquetado con la fecha de la cosecha de gusano y la fecha de HES collection. Después de 21 días de recolección de HES de la cultura, deseche gusanos. Piscina 500-1.000 ml de HES sobrenadante (por lo general de madre congelada, y no como la recogida primeras 24 h) y concentrarse sobre un filtro de 3.000 MWCO en el dispositivo de ultrafiltración bajo presión de nitrógeno. NOTA: Tenga mucho cuidado de no dejar correr el filtro seco. Para configurar el dispositivo de filtro, lavar primero el lado brillante de la membrana 3 kDa abajo en un vaso de precipitados de 1 litro con agua destilada durante 3 x 20 min mientras se agitaba. Montar el dispositivo de ultrafiltración según las instrucciones del fabricante con membrana de filtro lado brillante hacia arriba. Lugar en el gabinete a 4 ° C y pasar 50 ml de agua destilada a través antes de comenzar a concentrarse HES agrupados. Añadir cada tubo de HES en el dispositivo de filtración según sea necesario (100-140 ml por día), hasta que el volumen se concentró hasta 2-5 ml. Con el fin de eliminar los contaminantes de los medios de cultivo que contienen HES, añadir 50 ml de pyrfibrinógeno libre de PBS para el dispositivo de filtración y a continuación concentrar hasta aproximadamente 2 ml. Repita este paso dos veces (150 ml de PBS en total). Transferencia de HES en un tubo de 15 ml, esterilizar filtro (con un filtro de 0,2 micras) en una campana de flujo laminar y medir la concentración de proteína usando un espectrofotómetro (E 280 = 10) o por el ensayo de Bradford. Alícuota, etiqueta con el número de lote y la fecha, y la congelación a -80 ° C. Realizar un ensayo LAL cromogénico de acuerdo con los protocolos del fabricante en cada lote de HES antes de su uso. Si los niveles de LPS son mayores que 1 U LPS por 1 g de proteína, considere no utilizar este lote para experimentos in vivo o en cultivos in vitro. Procesar las HES recogidos a las 24 horas por separado de la misma manera; Contendrá LPS y algunas proteínas del huésped y, aunque no es adecuado para experimentos funcionales, es una fuente útil de moléculas individuales que pueden ser aislados mediante purificación por afinidad de anticuerpos monoclonales. </ol>