Cultivo de<em> Heligmosomoides polygyrus:</em> Um imunomodulador Nematode Parasite e seus produtos secretados

NOTA: Todos os procedimentos descritos neste protocolo são realizadas em conformidade com as diretrizes estabelecidas pelo Reino Unido Home Office ea Universidade de Edimburgo Serviços Veterinários. 1. infecção de camundongos por sonda Loja larvas Heligmosomoides polygyrus L3 em água destilada por até seis meses a 4 ° C. Antes da utilização, lavar larvas L3 três vezes em água destilada: centrifugar a 300 xg durante 10 min (com freio), mas remover todos os 500 ul de água (para evitar larvas L3 perturbador peletizada) e ressuspender o sedimento de cada vez. Para a terceira lavagem, adicionar água a um volume exato (normalmente 40 ml) e aspirado de 20 l com uma ponta de corte de 200 mL de alargar a sua abertura. Colocar duas amostras de 20 ul sobre a superfície de um prato de cultura de 60 mm e contar as larvas L3 (geralmente móvel, e melhor visualizado sob 50X de ampliação com um microscópio de dissecção). Ressuspender o sedimento final em água destilada a uma Concentraçãn de 2.000 larvas L3 por ml. Para a produção de ciclo de vida, infectar F1 (C57BL / 6xCBA) ratos oito semanas de idade, com 400 H. polygyrus larvas L3 em 200 mL de água destilada por sonda oral (ratos conter na posição vertical pela nuca do pescoço e passar suavemente a agulha de gavagem romba através da boca e do esófago para o estômago). Agitar bem antes de cada infecção (larvas resolver rapidamente em água) e 200 ul de aspirado numa seringa de 1 ml; utilizar uma agulha de gavagem dedicado com uma extremidade arredondada. Para a infecção experimental de ratos mais jovens (6-8 semanas de idade), ou outras estirpes puras (por exemplo, ratinhos C57BL / 6 ou BalbC), infectar ratinhos com 200 larvas L3. 2. Propagação e Manutenção de H. polygyrus Coloque carvão no centro de uma grande banheira de plástico e deixe a água fria da torneira a correr sobre ele para um mínimo de 30 min (carvão ativado unwashed é tóxica para as larvas L3). Escorra a água da banheira e coloque o carvão vegetal em two camadas de papel absorvente, deixando-o exposto ao ar ambiente até ficar completamente seca. Se forem necessários ovos, raspar fezes primeiro fora do cólon com uma pinça e tesouras (se necessário). Se for necessário um grande número de larvas L3, colocar em ratinhos uma grelha de arame e recolher partículas fecais ao longo de vários dias. Misturar as fezes com carvão granulado numa proporção de pelo menos 1: 1, para atingir uma consistência suficiente para amortecer apenas aderir a papel de filtro. Espalhar uma camada fina sobre o centro de algum papel de filtro umedecido em uma placa de Petri e colocar isso em uma caixa úmido (adicione um pouco de toalha de papel úmido e um prato de água) no escuro durante 12-14 dias. Remover larvas L3 a partir do dia 7 em diante, e recolhê-las em pelo menos duas ocasiões antes do papel ser descartado. As larvas formar um anel em torno da borda do papel de filtro; levantar o papel de filtro para fora do prato de petri e enxaguar as larvas que estão à esquerda da placa (usando uma pipeta, 5 ml de água estéril por placa) para um tubo de 50 ml. Elevadorfora do papel de filtro e colher as larvas restante deixado na placa com água destilada para um tubo de 50 ml. Centrifuga-se a solução efluente a 300 xg durante 10 min. Lavar as larvas três vezes com água destilada e, em seguida, armazenar a 4 ° C no máximo de 50 ml de água destilada, até ser necessário. NOTA: As larvas permanecem viáveis ​​e infectantes por pelo menos 6 meses. 3. Cobrança de Adulto H. polygyrus Worms Prepare o Aparelho de Baermann modificado com antecedência como mostrado na Figura 1. Cull ratinhos 14 dias após a infecção. Lavar o abdómen com etanol a 70%. Corte a pele sobre o abdômen e puxar para trás para revelar a parede abdominal anterior. Fazer incisão na linha média para entrar na cavidade peritoneal. Remover todo o intestino delgado e grande (a partir de duodeno proximal para distal recto). Colocar num prato de Petri e seco. Endireitar o intestino ao longo de todo o seu comprimento; excisar o cólon fezes contendo; colocar isso em um prato separado para ovos preparações posteriores. Extirpar o proximais 20 cm de intestino delgado que contém os vermes adultos -identified pela parede relativamente espessa do duodeno e muitas vezes uma aparência vermelho devido aos vermes intra-luminais. Colocar em um (100 mm de diâmetro) caixa de Petri com 5 ml de solução de Hanks, aquecido a 37 ° C (dois espécimes por prato). Abra a porção proximal do intestino cheio de verme longitudinalmente com a tesoura (tesoura redondas-ended são os melhores para isso), e raspar para baixo dentro do intestino alinhando com duas lâminas de vidro para remover os vermes. Em seguida, descartar a parede do intestino limpo. Dica vermes em pequenos sacos de musselina, grampo fechado e seguro, com clipes de papel ao redor da borda do funil de vidro (Figura 1). Preencha funil com solução de Hanks e adicionar cerca de 4 placas de Petri de vermes em cada funil. Local aparelho em 37 ° C incubadora durante 1-2 horas, agitando suavemente a meio para desalojardetritos a partir da preparação do intestino que podem ocluir o filtro de musselina. Tome cuidado para evitar o derramamento de detritos fora do saco de musselina – isso fará com que a contaminação da preparação final HES. Os vermes adultos deveria ter migrado lentamente através do pano de musselina e estabeleceu-se na parte inferior do tubo de ensaio de vidro. Retirar cuidadosamente o tubo de ensaio da mangueira de borracha que liga em cima da pia (tendo o cuidado de evitar a perda de vermes neste momento). Usando uma pipeta de plástico, transferir os vermes em um tubo de 50 ml e lavar seis vezes com Hanks Solution (permitir vermes de se contentar com a gravidade, ao remover a mídia com um stripette, adicione 40 ml de Hanks Solution e repita cinco vezes). NOTA: cultura verme deve ser mantido estéril a partir deste ponto em diante. Mover para uma câmara de fluxo laminar e lavar mais seis vezes em solução estéril de Hank suplementado com 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina, pronto para a cultura in vitro. Contar overmes adultos recuperados por tomar duas amostras de 20 l retomado com um corte de ponta amarela de alargar a sua abertura; esperar que aproximadamente 50% da quantidade de larvas inoculadas. 4. Configurando culturas para HES: Preparação Médio, lavagem vermes adultos Embeber os vermes de 3,11 em cerca de 10 ml de RPMI suplementado com 10% de gentamicina durante 20 min, deixando o tubo de repouso em um ângulo para assegurar vermes são totalmente cobertas. Executar esta numa câmara de fluxo laminar: lavar novamente seis vezes com a solução de Hanks (suplementado com 5 U / ml de penicilina e 5 ug / ml de estreptomicina). Prepare H. media polygrus. A manutenção de esterilidade numa capela de fluxo laminar, para 500 ml de RPMI 1640, adicionar 11,1 mL de 45% de glucose (concentração final 1,2% em RPMI1640 contém 0,2% de glucose), 5 ml de 100x Peniclllin-Estreptomicina (concentração final de 5 U / ml de penicilina, 5 ug / ml de estreptomicina), 5 mL de L-glutamina (concentração final 2 mM), e5 ml de gentamicina (concentração final de 1%). Não adicione FCS. Vermes alíquotas em frascos T25 ventilados, aprox. 1.000 vermes em 15 ml H. polygyrus media por frasco, e coloque na posição vertical em 37 ° C incubadora (5% de CO 2) por 3 semanas. 5. Preparação de HES Recolha HES contendo meio de cultura a partir de culturas em intervalos de não mais do que duas vezes por semana, deixando de lado a primeira coleção após 24 horas de cultura (devido aos altos níveis de contaminação LPS e proteínas do hospedeiro – podem ser processados ​​separadamente ou descartados). Mantenha cada recolha selectiva e claramente marcado com a data e número do lote. Substitua-o por um volume igual de H. polygyrus media em cada ocasião. Centrífuga-HES contendo meio a 400 x g durante 5 min. Em seguida, filtrar esterilizar através 0,2 mm filtros de baixa proteína de ligação em tubos de 50 ml. Loja no freezer -20 ° C claramente identificada com data de verme colheita e data de HES collection. Após 21 dias de coleta de HES de cultura, descarte worms. Piscina 500-1000 ml de HES sobrenadante (geralmente a partir de estoque congelado, e não incluindo a recolha hr primeiro 24) e se concentram sobre um filtro 3000 MWCO no dispositivo de ultrafiltração sob pressão de azoto. NOTA: Tenha muito cuidado para não deixar a corrida filtro seco. Para configurar o dispositivo de filtro, primeiro lave 3 membrana kDa lado do brilhante para baixo num copo de 1 litro com água destilada por 3 x 20 min com agitação. Monte o dispositivo de ultrafiltração, conforme as instruções do fabricante, com membrana de filtro lado brilhante para cima. Em lugar do armário, a 4 ° C e passar 50 ml de água destilada através antes de começar a concentrar HES reunidas. Adicionar a cada tubo de HES no dispositivo de filtração, conforme necessário (100-140 mL por dia), até que o volume é concentrada até 2-5 ml. A fim de remover os contaminantes do meio de cultura contendo HES, adicionar 50 ml de pirogénio-PBS livre para o dispositivo de filtração e, em seguida, concentrar e para baixo a cerca de 2 ml. Repetir este passo duas vezes (150 ml de PBS no total). Transferir HES em um tubo de 15 ml, esterilizar filtro (com um filtro de 0,2 um) numa câmara de fluxo laminar e medir a concentração de proteína usando um espectrofotómetro (E 280 = 10) ou pelo ensaio de Bradford. Aliquota, a etiqueta com o número de lote e data, e congelamento a -80 ° C. Realizar um ensaio de LAL cromogénico de acordo com os protocolos do fabricante em cada lote de HES antes da utilização. Se os níveis de LPS são maiores do que 1 U LPS por 1 mg de proteína, considere não usar este lote para experimentos in vivo ou em culturas in vitro. Processar os HES recolhidos às 24 h separadamente da mesma maneira; ele conterá LPS e algumas proteínas do hospedeiro e, enquanto não é adequado para experiências funcionais, é uma fonte útil de moléculas individuais que podem ser isolados por purificação de afinidade de anticorpo monoclonal. </ol>