Teelt van<em> Heligmosomoides Polygyrus:</em> Een Immunomodulatory Nematode Parasite en haar uitgescheiden producten

OPMERKING: Alle procedures in dit protocol worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen die door het Verenigd Koninkrijk van Binnenlandse Zaken en de Universiteit van Edinburgh Veterinary Services instellen. 1. Infectie van Muizen door Gavage Store Heligmosomoides polygyrus L3 larven in gedestilleerd water voor maximaal zes maanden bij 4 ° C. Voor het gebruik, wassen L3 larven drie keer in gedestilleerd water: centrifuge bij 300 xg gedurende 10 min (met rem), verwijder alle maar 500 ul van water (om storende gepilleerd L3 larven te voorkomen) en resuspendeer de pellet elke keer. Voor de derde maal, voeg water toe tot een exacte volume (gewoonlijk 40 ml) en zuig 20 gl met 200 ul tip gesneden zijn opening verbreden. Plaats twee 20 ul monsters op het oppervlak van een 60 mm kweekschaal en tel de L3 larven (meestal mobiel en best bekeken onder 50x vergroting met een dissectie microscoop). Resuspendeer de laatste pellet in gedistilleerd water om een ​​concentration van 2.000 L3 larven per ml. Voor levenscyclus productie, infecteren 8 weken oude F1 (C57BL / 6xCBA) muizen met 400 H. polygyrus L3 larven in 200 ul van gedestilleerd water door orale sondevoeding (bedwingen muizen in de verticale positie door de nekvel en voorzichtig langs de botte maagsonde naald door de mond en de slokdarm naar de maag). Schud grondig vóór elke infectie (larven vestigen snel in water) en zuig 200 ui in een spuit van 1 ml; gebruik maken van een speciale sondenaald met een afgerond uiteinde. Voor experimentele infectie van jongere muizen (6-8 weken oud), of andere ingeteelde stammen (bijvoorbeeld C57BL / 6 of BALBc), infecteren muizen met 200 L3 larven. 2. Voortplanting en onderhoud van H. polygyrus Plaats houtskool in het centrum van een grote plastic kuip en laat koud leidingwater te lopen over het voor een minimum van 30 min (ongewassen actieve kool is giftig voor L3 larven). Tap het water uit het bad en plaats de houtskool op two lagen van absorberend papier, waardoor het blootgesteld aan lucht in de ruimte tot het volledig droog. Als eieren vereist, schraap uitwerpselen eerst uit het colon met een tang (en schaar indien nodig). Als een groot aantal L3 larven nodig, plaatst muizen op een draadrooster en laat fecale pellets gedurende enkele dagen. Meng de ontlasting met gekorrelde houtskool in een verhouding van ten minste 1: 1, tot een consistentie net vochtig genoeg te houden aan filtreerpapier. Smeer een dunne laag op het midden van een aantal vochtige filtreerpapier in een petrischaal en plaats deze in een vochtige doos (voeg wat vochtige papieren handdoek en een schotel van water) in het donker voor de 12-14 dagen. Verwijder L3 larven van dag 7 verder, en verzamel ze op ten minste twee keer voordat het papier wordt weggegooid. De larven een ring rond de rand van het filtreerpapier; Til het filter papier uit de petrischaal en spoel de larven die nog over zijn van de plaat (met behulp van een pipet en 5 ml steriel water per plaat) in een 50 ml buis. Liftuit het filter met het oogsten van de resterende larven links op de plaat met gedestilleerd water in een 50 ml buis. Centrifugeer het effluent oplossing bij 300 xg gedurende 10 min. Was de larven driemaal met gedestilleerd water en bewaar bij 4 ° C bij 50 ml gedestilleerd water tot nodig. OPMERKING: Larven levensvatbaar blijven en besmettingen ten minste 6 maanden. 3. Het verzamelen van Adult H. polygyrus Worms Bereid de gemodificeerde Baermann Inrichting tevoren figuur 1. Ruiming muizen veertien dagen na infectie. Was de buik met 70% ethanol. Snijd de huid over de buik en trek terug naar de voorste buikwand onthullen. Maak middellijn incisie aan de peritoneale holte voeren. Verwijder de gehele dunne en dikke darm (van proximale twaalfvingerige darm tot distale rectum). Leg in een droge petrischaal. Strek de darm over de volledige lengte; uitsnijden de ontlasting bevattende colon; plaats deze in een apart schaaltje voor ei voorbereidingen later. Accijnzen de proximale 20 cm van de dunne darm dat de volwassen wormen -identified door de relatief dikke wand van het duodenum en vaak een rode uitstraling door de intra-luminale wormen bevat. Plaats in een (100 mm diameter) petrischaal met 5 ml Hanks 'oplossing, verwarmd tot 37 ° C (twee monsters per schaal). Open de-worm gevuld proximale darm deel in de lengte met een schaar (round-ended schaar zijn het beste voor deze), en schraap beneden binnenkant van de darm voering met twee glaasjes om de wormen te verwijderen. Gooi dan de schone darmwand. Tip wormen in kleine mousseline tassen, nieten gesloten en veilig met paperclips rond de rand van de glazen trechter (figuur 1). Vul trechter met Hanks 'Solution en voeg ongeveer 4 petrischalen van wormen in elke trechter. Zet het apparaat op 37 ° C incubator voor 1-2 uur, halverwege voorzichtig schudden door te verjagenpuin van de darm voorbereiding die de mousseline filter kan verstoppen. Zorg ervoor dat het morsen van puin buiten de mousseline zak te vermijden – dit zal vervuiling van de uiteindelijke HES voorbereiding veroorzaken. Volwassen wormen moet langzaam gemigreerd door neteldoek en zich op de bodem van de glazen reageerbuis. Voorzichtig los van de reageerbuis uit het aansluiten van rubberen slang boven de gootsteen (zorg om te voorkomen dat wormen op dit punt). Met behulp van een plastic pipet de wormen in een 50 ml buis en was zes keer met Hanks 'Solution (laten wormen om media af te wikkelen met de zwaartekracht, verwijderen met een stripette, voeg 40 ml Hanks' oplossing en herhaal vijf keer). OPMERKING: worm cultuur moet steriel gehouden worden vanaf dit punt. Naar een laminaire stroming kap en was nog zes keer in oplossing steriele Hanks 'aangevuld met 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine, klaar voor in vitro kweek. Tel devolwassen wormen hersteld door het nemen van twee monsters van 20 ul in beslag genomen met een gele tip gesneden om haar diafragma te verruimen; verwachten dat ongeveer 50% van de hoeveelheid geënte larven. 4. Installatie culturen voor HES: Medium Voorbereiding, wassen volwassen wormen Week de wormen 3.11 ongeveer 10 ml RPMI aangevuld met 10% gentamycine gedurende 20 minuten, waardoor de buis rust in een hoek te waarborgen wormen volledig afgedekt. Voer deze in een laminaire stroming kap: Was opnieuw zesmaal Hanks 'oplossing (aangevuld met 5 U / ml penicilline en 5 ug / ml streptomycine). Bereid H. polygrus media. Handhaving steriliteit in een laminaire stroming kap, 500 ml RPMI1640, voeg 11,1 ml 45% glucose (eindconcentratie 1,2% als RPMI 1640 bevat 0,2% glucose), 5 ml 100x Peniclllin-streptomycine (eindconcentratie 5 U / ml penicilline, 5 ug / ml streptomycine), 5 ml L-glutamine (eindconcentratie 2 mM), en5 ml gentamycine (eindconcentratie 1%). Laat FCS niet toevoegen. Portie wormen in ontlucht T25 flessen, ong. 1000 wormen in 15 ml H. polygyrus media per fles, en plaats rechtop in 37 ° C incubator (5% CO 2) gedurende 3 weken. 5. Bereiding van HES Verzamel HES-bevattende kweekmedia uit culturen met tussenpozen van niet meer dan twee keer per week, afgezien van de eerste collectie na 24 uur van de cultuur (vanwege de hoge niveaus van LPS besmetting en gastheereiwitten – kan apart worden verwerkt of verwijderd). Houd elke collectie gescheiden en duidelijk zijn gemarkeerd met de datum en het nummer van de partij. Vervangen door een gelijk volume H. polygyrus media bij elke gelegenheid. Centrifuge HES-bevattende media bij 400 x g gedurende 5 min. Vervolgens filteren steriliseren door 0,2 micrometer eiwitarme-bindend filters in 50 ml buizen. Bewaren in de -20 ° C vriezer duidelijk gelabeld met datum van worm oogst en datum van HES collectie. Na 21 dagen van HES collectie van cultuur, gooi wormen. Pool 500-1.000 ml HES supernatant (meestal van bevroren voorraad, en niet met inbegrip van de eerste 24 uur verzamelen) en concentreer je dan een 3000 MWCO filter in de ultrafiltratie apparaat onder stikstofdruk. LET OP: Wees zeer voorzichtig het filter drooglopen niet te laten. Voor het instellen van het filter apparaat, eerst was de 3 kDa membraan glimmende kant naar beneden in een 1 liter beker met gedestilleerd water gedurende 3 x 20 min roeren. Monteer de ultrafiltratie inrichting volgens instructies van de fabrikant met filtermembraan glanzende zijde. Plaats in de kast bij 4 ° C en laat 50 ml gedestilleerd water door voordat u begint met gepoolde HES concentreren. Naar elke buis van HES in de filtratie-inrichting vereist (100-140 ml per dag), totdat het volume geconcentreerd tot 2-5 ml. Om verontreinigingen uit de HES-bevattende kweekmedia verwijderen, 50 ml pyr voegenOgen-vrij PBS om de filterinrichting en vervolgens ingedampt tot ongeveer 2 ml. Herhaal deze stap tweemaal (150 ml PBS in totaal). Breng HES in een 15 ml buis, filter steriliseren (met een 0,2 urn filter) in een laminaire stroming kap en eiwitconcentratie te meten met een spectrofotometer (E 280 = 10) of door Bradford assay. Portie, label met batchnummer en datum, en bevriezen bij -80 ° C. Voer een chromogene LAL assay volgens de protocollen van de fabrikant op elke partij HES vóór gebruik. Als LPS niveaus groter dan 1 U LPS per 1 ug eiwit overwegen niet deze batch in vivo of in vitro culturen. Verwerk de gegevens over 24 uur apart op dezelfde wijze HES; zal LPS en enige gastheer eiwitten en, hoewel niet geschikt voor functionele experimenten, is een nuttige bron van individuele moleculen die door monoklonaal antilichaam affiniteit zuivering kan worden geïsoleerd. </ol>