种植<em> Heligmosomoides Polygyrus：</em>免疫调节线虫寄生虫及其分泌产物

注：在本协议中的所有程序都是按照载列由英国内政部和爱丁堡兽医服务的大学指导进行。 1.感染小鼠灌胃商店Heligmosomoides polygyrus L3幼虫在蒸馏水中长达六个月，在4℃。 在使用前，洗L3幼虫三次蒸馏水：离心机在300×g离心10分钟（与制动器），除去的水几乎500微升（以避免扰乱丸状L3幼虫）和每一次重悬沉淀。 对于第三次洗涤，用200μl的尖端切割加水到一个确切的体积（通常为40毫升）和抽吸20微升，以扩大其孔径。放置两个20微升样品60毫米培养皿的表面上并计算幼虫的L3（通常是移动的，并且下50X放大率最佳效果与解剖显微镜）。悬浮在蒸馏水中最终沉淀到concentration个每毫升2000 L3幼虫。 对于生命周期的生产，感染8周岁的F1（C57BL / 6xCBA）小鼠400 H. polygyrus L3幼虫在200μl蒸馏水中通过口服管饲法（由颈背抑制小鼠在直立位置并轻轻穿过口腔和食道的钝灌胃针进入胃）。彻底搅动之前，每个感染（幼虫尽快解决水）和吸200微升以1毫升注射器;使用专用的管饲针以一圆形端。对实验性感染年轻小鼠（6-8周龄），或其它近交系（ 例如 C57BL / 6或BALBC），感染小鼠200的L3幼虫。 2.传播和H.保养polygyrus 放置木炭在一个大的塑料桶的中心，并允许冷自来水以运行在它为至少30分钟（未洗的活性炭是有毒至L3幼虫）。从桶排出水，并放置在吨的炭WO层的吸水纸，离开它暴露在室内空气直至完全干燥。 如果蛋是必需的，刮屎先用钳子结肠（和剪刀如有必要）。如果需要大量的L3幼虫，将小鼠上的线栅和持续数天收集粪便颗粒。 混合与造粒木炭粪便以至少1：1的比例，以实现一致性刚好足够潮湿坚持滤纸。涂抹一薄层上有些挫伤滤纸的中心在培养皿并将其放置这在潮湿箱在黑暗中（加一些湿纸巾和水皿）为12-14天。 从第7天起除去L3幼虫，并收集它们在至少两个场合纸张被丢弃之前。幼虫形成围绕滤纸的边缘环;提起滤纸出培养皿和冲洗被留在板的（用移液管和5ml每板用无菌水）到50ml管中的幼虫。 电梯断滤纸和收获剩余幼虫残留在板上用蒸馏水至50ml管中。离心在300×g离心流出物溶液10分钟。三次，用蒸馏水洗涤幼虫，然后在4℃下在高达50毫升蒸馏水储存直到需要。 注：幼虫保持存活和感染性为至少6个月。 3.收集成人的H. polygyrus蠕虫制备改性贝尔曼装置提前， 如图1。 卡尔小鼠感染后十四日。 洗用70％乙醇的腹部。切开皮肤在腹部和拉回来，露出前腹壁。使中线切口进入腹腔。 删除整个小肠和大肠（从近端十二指肠远端直肠）。放入干燥的培养皿中。 拉直沿其整个长度的肠;切除含粪便冒号;把这个成蛋的准备后，一个单独的菜。 切除近端20厘米×小肠含有由于内部管腔蠕虫由比较厚的墙体十二指肠和经常红色外观的修正 – 重新鉴定成虫。放置成（直径100mm）的培养皿用5ml的Hanks'溶液，加热到37℃（每皿2样品）。 用剪刀（圆头剪刀是最适合这个）纵向打开蠕虫填充近端肠道部分，并且向下刮肠里面有两个载玻片衬删除蠕虫。然后丢弃干净的肠壁。 尖端蠕虫成小棉布袋，钉封闭，并与周围的玻璃漏斗（ 图1）的边缘纸夹固定。 填写漏斗与汉克斯的解决方案，并添加蠕虫大约4培养皿到每一个漏斗。 在37℃培养箱地方设备1-2小时，通过轻轻搅拌中途赶走碎片从肠道准备，可能会堵塞细布过滤器。请注意，以避免棉布袋外碎片溢出 – 这将导致最终HES制剂的污染。成虫应该通过细棉布缓慢迁移和在玻璃试管的底部结算。仔细分离从连接橡胶软管在水槽的试管（注意避免在这一点上失去蠕虫）。 使用塑料移液管，转移蠕虫到50ml管中并洗涤六次用Hanks'溶液（允许蠕虫解决与重力，除去介质用stripette，添加40毫升汉克斯'解并重复5次）。 注意：蠕虫的文化必须保持无菌从这时开始。 移动到层流罩和在无菌Hanks液补充有100U / ml青霉素和100μg/ ml链霉素，准备用于体外培养洗另一六次。 算通过采取两个样本，以扩大其光圈拍摄了黄色针尖削减20微升恢复成虫;期望接种幼虫的数量的约50％。 4.设置了文化HES：中等准备，洗成虫泡从3.11蠕虫在大约10毫升的RPMI的补充有10％庆大霉素20分钟，而使管搁在一个角度，以确保蜗杆完全覆盖。 执行此在一个层流罩：用Hanks'溶液再次洗涤六次（补充有5 U / ml的青霉素和5微克/ ml链霉素）。 准备H. polygrus媒体。 保持无菌的层流罩，至500ml的RPMI1640，加11.1毫升45％葡萄糖（终浓度为1.2％的RPMI1640作为含有0.2％葡萄糖），将5ml 100×Peniclllin – 链霉素（终浓度5U / ml青霉素的， 5微克/ ml链霉素），将5ml L-谷氨酰胺（最终浓度为2mM），并5毫升庆大霉素（终浓度为1％）。不添加FCS。 分装成蠕虫通风T25瓶，约1000蠕虫在15ml H。每瓶polygyrus介质，并置于直立在37℃培养箱（5％CO 2）3周。 5.准备的HES 收集HES-含有培养物的培养基中以不超过两次，每周较长的时间间隔，在培养24小时后，搁置所述第一集合（由于高含量的LPS污染及宿主蛋白质的 – 可单独处理或丢弃）。保持每个单独收集，并明确标有日期和批号。更换H.等体积polygyrus媒体每次。 离心机HES-含有介质，在400×g下5分钟。然后过滤通过0.2微米的低蛋白结合过滤器消毒到50ml管中。储存在-20°C冰箱标明蠕虫收获日期HES的c和日期ollection。 经过从文化21天HES收集，丢弃蠕虫。 池500-1000毫升HES上清液（通常从冷冻的储存，并且不包括第一24小时收集），并在氮气压力下浓缩过的超滤装置中的3000 MWCO过滤器。 注意：要非常小心，不要让过滤器运行干燥。 设置的过滤器装置中，首先在1升的烧杯中，用蒸馏水向下洗3 kDa的膜光泽面为3×20分钟，同时搅拌。组装超滤装置按制造商的使用滤光膜光泽面向上的指令。发生在内阁在4℃，并开始集中汇集HES前一次的50毫升蒸馏水通过。 加入HES的每个管进入过滤装置所要求（每天100-140毫升），直到体积浓缩至2-5毫升。 为了从含有HES培养基除去污染物，加50毫升吡的ogen无PBS的过滤装置和，然后浓缩降至大约2毫升重复此步骤两次（150毫升PBS中的总数）。转移HES入15ml管中，过滤消毒（用0.2微米过滤器）在层流罩和使用分光光度计（E 280 = 10）或通过Bradford测定法测定蛋白质浓度。 等分试样，标记与在-80℃下批号和日期，并冷冻。 根据制造商对每一个批次的HES的使用前的协议执行生色LAL测定。如果LPS水平高于每1微克蛋白1 U LPS，考虑不使用此批体内实验和体外培养。 处理分别以相同的方式收集在24小时的HES;它将包含LPS和一些宿主蛋白质，虽然不适合功能实验，它是可以由单克隆抗体亲和纯化来分离单个分子的有用来源。 </ol>