Experimental glaucoma inducido por inyección ocular de microesferas magnéticas

Declaración de Ética: Todos los experimentos con animales se han realizado de acuerdo con el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC), y fueron aprobados de acuerdo con las directrices del Reino Unido Home Office ( http://goo.gl/FLkirW , consultado el pasado 10 de junio , 2014) y la Declaración de ARVO para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research ( http://goo.gl/4LFOjD , consultado el pasado 10 de junio, 2014). 1. Hipertensión Ocular Inducción Inducir glaucoma experimental mediante la elevación de la presión intraocular (PIO) a través de la inyección unilateral de microesferas paramagnéticas en la cámara anterior de las ratas Brown Norway, basado en el método de Samsel et al. 3 Otros ratas pigmentadas pueden ser adecuados, aunque éstos tendrían que ser validado primero por el usuario. Casa 250-300 g femeninoratas ex criador Brown Norway en un ambiente con poca luz constante (40-60 lux) para minimizar las fluctuaciones diurnas de la PIO 7, con el acceso a alimentos y agua ad libitum. Tomar mediciones de la PIO de línea base en animales despiertos 8 antes de la anestesia y la inyección del grano, usando un tonómetro de rebote calibrada para su uso en el ojo de rata 9. IOP se toma como la media de cinco lecturas. Anestesiar ratas con 37,5 mg / kg de ketamina, y 0,25 mg / kg de medetomidina clorhidrato entregado por vía intraperitoneal. Confirmar profundidad de la anestesia mediante el ensayo reflejos del pie trasero de animales, antes de la aplicación povidona yodo (véase el paso 1.5), y la inyección de talón (véase el paso 1.8). Administrar 0,5% de clorhidrato de proparacaína para la analgesia. NOTA: No dilatar la pupila en cualquier etapa. Esto ayudará a que las perlas se asientan mejor en el ángulo iridocorneal, y evitar la unión a la lente. Aplique una pomada ocular para prevenir la sequedad de la córnea en el ojo contralateral no operado. Wcenizas del ojo operativa con 5% de yodo povidona en agua 10 5 min antes de la inyección. Después de 5 min, Wick la povidona yodada fuera usando una gasa estéril, y lavar el ojo con solución salina estéril al 0,9%. Mantenga el ojo húmedo durante la anestesia con la aplicación regular de solución salina estéril. Coloque un imán toroidal alrededor del ojo. Inyectar 25 l de una solución que contiene 30 mg / ml de irradiación gamma esterilizado 8 micras microesferas magnéticas en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) en la cámara anterior, utilizando una aguja biselada 33 G. Para preparar perlas, lavar por la re-suspensión, centrifugando a continuación 3 veces a 10.000 xg durante 5 min con 1 ml de HBSS, antes de hacer el / ml solución 30 mg final. Mantener condiciones estériles en todo. Para la inyección, tener cuidado de evitar la inserción de la aguja para el iris, para minimizar el riesgo de trauma iris. Esto se puede prevenir orientando la aguja tangencial a la superficie de la córnea, como paralelo ael iris como sea posible. Esto también ayudará a minimizar la pérdida de talón desde el sitio de inyección. NOTA: Inyectar cuentas a un ritmo rápido para asegurar una distribución uniforme en todo el ángulo iridocorneal, que es fundamental para elevar la PIO. Además, los granos de tiendas, agujas y anillos magnéticos por separado de modo que las perlas no forman agrupaciones, haciéndolos difíciles de cargar en la jeringa e inyectar, y la aguja no se magnetizan. Deje la aguja en su lugar durante 1 min después de la inyección para asegurar que los granos se depositan en el ángulo iridocorneal para impedir el drenaje acuoso de la malla trabecular. Ligeramente ángulo de la aguja después de las cuentas se han establecido inicialmente para permitir cierta fuga de acuoso, para minimizar los aumentos transitorios de la presión intraocular. Al final de la cirugía limpiar la aguja a través con la primera salina tamponada con fosfato (PBS), luego etanol al 70%, seguido de agua destilada, para asegurar el uso continuado de la aguja en procedimientos separados. Alternativamente, se podría usaragujas desechables si la combinación correcta de calibre y una jeringa está disponible. Opcional: agujas pueden ser afiladas utilizando un beveller para prolongar su uso. En esta etapa, si es necesario, retire el imán, y lo utilizan para sacar cuentas en áreas de cobertura incompleta. Deje el imán en su lugar alrededor de los ojos para un 10 minutos después de la inyección de más para garantizar los granos se asientan bien en el ángulo iridocorneal. Anestesia inversa utilizando 0,25 mg / kg atipemezole clorhidrato. Administrar cloranfenicol, u otro ungüento antibiótico, por ejemplo gentamicina o terramicina por vía tópica para prevenir la infección, y 0,5% de clorhidrato de proparacaína para la analgesia. Deje a los animales para recuperar en una estera de calor hasta que recuperar el movimiento, a continuación, transferir a una caja caliente y de suministro con la nutrición adicional, tal como un suplemento alimenticio o dieta regular humedecido hasta que la recuperación es completa. Analgesia sistémica o local se debe dar a los animales que presenten signos de dolor de 24 horas después de la cirugía. Si thessíntomas e persisten a pesar del tratamiento, los animales deben ser sacrificados humanitariamente. Utilice el ojo contralateral como control no operado. Tomar mediciones de la PIO cada 2-3 días después de la administración de perlas, y cada 2-3 días a partir de entonces utilizando un tonómetro de rebote calibrada para su uso en el ojo de la rata 9. Los criterios para la inclusión de los ojos en los estudios pueden ser: si 1) la PIO se eleva por encima de la presión de control contralateral por 5 mmHg, y 2) no excederá de 60 mmHg. Ojos, donde la presión vuelve a la línea de base (generalmente por 1 semana después de la inyección) no deben ser incluidos en los estudios, sin embargo, es posible volver a inyectar los granos en los ojos que no logran desarrollar una PIO elevada si se desea. La eutanasia a los animales por asfixia de CO 2 al final del experimento. Diseccionar los ojos y los nervios ópticos, y fijar en el 4% de paraformaldehído (PFA) durante la noche para su posterior análisis histológico. 2. Evaluación de la retina Neurona daños Usando TUNEL STaining Para cuantificar las células apoptóticas en todo el montaje retinasuse el ensayo de deoxinucleotidil transferasa terminal mediada por dUTP nick-etiquetado (TUNEL), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Diseccionar la retina de la copa para el ojo, para lavar 3 x 5 min en 0,3% de Triton X-100 en tampón fosfato salino (PBS-T). Permeabilizar el tejido en 3% T-PBS durante 2 hr. Pre-equilibrar retinas en tampón de equilibrio durante 10 min, antes de la incubación en solución de reacción TUNEL durante 1 hora a 37 ° C. Lave el tejido durante 3 x 5 min en 0,3% T-PBS, enjuague en 0,3% T-PBS que contenía 5 mM DAPI y montaje plana en los medios de montaje. Para cuantificar los núcleos TUNEL positivas utilizan un microscopio confocal de tomar 10 micras z-pilas a través de la capa de células ganglionares de 20 aumentos. Tomar 3 imágenes en cada uno de los 4 pétalos, en sitios cercanos al nervio óptico, en la periferia media, y en la lejana periferia de la retina, dando un total de 12 imágenes por toda mount, el muestreo de aproximadamente 7.000 células. Criterios morfológicos discriminados células no neuronales (endotelial y glial) de las células neuronales. Seleccione las áreas de imagen utilizando sólo el canal DAPI, y los investigadores de la máscara a los grupos de tratamiento. 3. La evaluación de daño del nervio óptico Usando azul de toluidina tinción Fijar nervios ópticos durante la noche en solución de Karnovsky a 4 ° C. Tratar las muestras durante 2 horas en 1% (w / v) de tetróxido de osmio y luego deshidratar en etanol al 100%. Incubar nervios ópticos en óxido de propileno durante 30 minutos, y el lugar en una mezcla 50:50 de óxido de propileno: durante la noche araldite. Cambie esta solución a 100% araldite, seguido de incubación durante la noche a 60 ° C. Cortar semifinas secciones (0,75 mm de espesor) y mancha con 1% de azul de toluidina / bórax (TB) en etanol al 50% antes del examen con el microscopio óptico. 4. Análisis estadístico Realizar ana estadísticalyses usando un paquete de software estadístico apropiado. Un ANOVA de dos vías con la prueba post-hoc de Newman-Keul se puede utilizar para calcular la significación estadística para la PIO cambia con el tiempo. Un valor de p menor de 0.05 puede ser considerado significativo.