Экспериментальная Глаукома индуцированная глазной инъекций магнитных микросфер

Этика заявление: Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC), и они были одобрены в соответствии с руководящими принципами внутренних дел Великобритании ( http://goo.gl/FLkirW , в последний раз обращались 10 июня , 2014) и себе ARVO для использования животных в офтальмологических и Vision Research ( http://goo.gl/4LFOjD , в последний раз обращались 10 июня 2014 года). 1. глазной гипертензии индукции Вызвать экспериментальной глаукомы путем повышения внутриглазного давления (ВГД) с помощью одностороннего введения парамагнитных микросфер в переднюю камеру Коричневый Норвегии крыс, основанный на методе Samsel и др. 3 Другие пигментированные крысы могут быть пригодны, но они должны быть проверены первый пользователем. Дом 250-300 г женщинаэкс-селекционер Браун Норвегия крысы в постоянном условиях низкой освещенности (40-60 люкс) для сведения к минимуму суточные колебания ВГД 7, с доступом к пище и воде вволю. Возьмем измерения базовых IOP у бодрствующих животных 8 до анестезии и инъекции шарика, используя тонометр отскока калиброванный для использования в глаза крыс 9. ВГД берется как среднее из пяти измерений. Анестезировать крыс с 37,5 мг / кг кетамина и 0,25 мг гидрохлорида кг / медетомидина поставляемого внутрибрюшинно. Подтвердите глубины анестезии путем тестирования задние рефлексы ног животного, до йодповидон приложения (см шаг 1,5), и инъекции шарик (см шаг 1,8). Администрирование гидрохлорид пропаракаина 0,5% для обезболивания. ПРИМЕЧАНИЕ: Не расширить зрачок на любом этапе. Это поможет шарики для урегулирования лучше в передней камеры глаза углом, и предотвращения связывания с объективом. Применить глазной мази, чтобы предотвратить роговицы сушки на неоперированного противоположной глаза. Wпепел оперативную глаз с 5% повидон йода в воде 10 5 мин до инъекции. После 5 мин, фитиль повидон йод выключить, используя стерильную марлю и промыть глаза 0,9% стерильного физиологического раствора. Держите глаза влажные во время анестезии при регулярном применении стерильного физиологического раствора. Поставьте тороидальный магнит вокруг глаз. Вводят 25 мкл раствора, содержащего 30 мг / мл гамма-облучения стерилизованный 8 мкм магнитные микросферы Хэнка в сбалансированном солевом растворе (HBSS) в переднюю камеру, используя 33 г скошенную иглу. Для подготовки бусы, мыть с помощью повторного приостановления, то центрифугирования 3 раза при 10000 мкг в течение 5 мин с 1 мл HBSS, прежде чем принять окончательное 30 мг мл раствора /. Поддержание стерильных условий во всем. Для инъекций, будьте осторожны, чтобы избежать введения иглы в радужной оболочке, чтобы свести к минимуму риск диафрагмы травмы. Это можно предотвратить, ориентируясь иглу по касательной к поверхности роговицы, а параллельнодиафрагма, как это возможно. Это также поможет свести к минимуму потери шарик из места инъекции. ПРИМЕЧАНИЕ: Вводите шарики с большой скоростью, чтобы обеспечить равномерное распределение вокруг передней камеры глаза углом, что имеет решающее значение для повышения ВГД. Кроме того, магазин бусин, иглы и магнитные кольца отдельно, чтобы шарики не образуют кластеры, что затрудняет их загрузить в шприц и впрыснуть, и игла не намагничивается. Оставьте иглу на месте в течение 1 мин после инъекции для того, чтобы шарики поселиться в передней камеры глаза углом, чтобы воспрепятствовать водный дренаж из трабекулярной сети. Немного угол иглы после бисера изначально поселились, чтобы некоторые утечки водных, чтобы свести к минимуму кратковременное повышение ВГД. В конце операции промывки иглу через с первой фосфатным буферным раствором (PBS), а затем 70% -ным этанолом, а затем дистиллированной водой, чтобы обеспечить дальнейшее использование иглы в отдельных процедур. В качестве альтернативы, можно использоватьодноразовые иглы, если правильно калибра и шприц сочетание доступно. Дополнительно: иглы могут быть заточены с помощью станокТокарный продлить их использование. На этом этапе, если это необходимо, уберите магнит, и с его помощью нарисуйте бусы в областях неполного охвата. Оставьте магнит на месте вокруг глаз в течение еще 10 мин после инъекции, чтобы обеспечить гранулы оседают и в углу передней камеры глаза. Обратный анестезии с использованием гидрохлорида 0,25 мг / кг atipemezole. Администрирование хлорамфеникол, или другой антибиотик мазь, например гентамицином или террамицина местно, чтобы предотвратить инфекцию и 0,5% пропаракаина, гидрохлорид для обезболивания. Оставьте животных, чтобы восстановить на тепловой мат, пока они не восстановить движение, а затем перенести в теплом ящике и предложения с дополнительными питания, таких как пищевая добавка или смоченной обычной диете, пока восстановление не будет завершено. Системное или местное обезболивание должно быть уделено животных, отображающих признаки боли 24 ч после операции. Если Фесе симптомы сохраняются, несмотря на лечение, животные должны быть гуманно забито. Используйте контралатеральной глаз, как неоперированных контроля. Проведите измерения ВГД каждые 2-3 дней после введения борта, и каждые 2-3 дня после использования возвратным тонометром быть откалиброван для использования в глазе крысы 9. Критерии для включения глаза в учебе могут быть: если 1) ВГД повышается выше противоположной контроля давления в 5 мм рт.ст., и 2) не превышает 60 мм рт. Глаза, где давление возвращается к исходному уровню (обычно 1 недели после инъекции) не должны быть включены в исследованиях, однако можно снова залить шарики в глазах, которые не при желании развивать высокую ВГД. Эвтаназии животных СО 2 удушья в конце эксперимента. Проанализируйте глаза и зрительных нервов, и зафиксировать в 4% параформальдегида (PFA) в течение ночи для дальнейшего гистологического анализа. 2. Оценка нейрона сетчатки повреждения с помощью TUNEL SМодельный ряд Для количественной оценки апоптоза клетки в целом горе retinasuse клеммной дезоксинуклеотидтрансферазу-опосредованной дУТФ ник-маркировка (TUNEL) анализа, в соответствии с инструкциями изготовителя. Рассеките сетчатку от чашки глаз, промыть в течение 3 х 5 мин в 0,3% Triton X-100 в фосфатном буферном растворе (Т-PBS). Проницаемыми ткани в 3% T-PBS в течение 2 часов. Предварительно равновесие сетчатки в уравновешивающим буфером в течение 10 минут, перед инкубацией в TUNEL реакционного раствора в течение 1 ч при 37 ° С. Вымойте ткань для 3 х 5 мин в 0,3% Т-PBS, промыть в 0,3% T-PBS, содержащий 5 мкМ DAPI, и телевизор с плоским установки в монтажных средств массовой информации. Для количественной оценки TUNEL положительных ядер с помощью конфокальной микроскопии принять 10 мкм Z-стеки через ганглиозных клеток слоя при 20-кратным увеличением. Принимать 3 изображений на каждой из 4 лепестков, на участках, близких к зрительному нерву, в середине периферии, и на дальнем периферии сетчатки, что в общей сложности 12 изображений в целом Моунт, отбора проб приблизительно 7000 клеток. Морфологические критерии дискриминации ненейронных (эндотелиальных и глиальных) клеток от нервных клеток. Выберите области для работы с изображениями, используя только DAPI канал, и маска следователей по группам лечения. 3. Оценка зрительного нерва повреждения с помощью толуидиновым синим окрашиванием Исправить зрительные нервы в течение ночи в растворе Карновского в при 4 ° С. Treat образцов в течение 2 ч в 1% (вес / объем) осмия, а затем обезвоживают в 100% -ном этаноле. Выдержите зрительные нервы в окиси пропилена в течение 30 мин, и поместите в 50:50 оксида пропилена: ARALDITE ночь. Изменение этого раствора до 100% Araldite с последующей инкубацией в течение ночи при 60 ° С. Cut полутонких секции (толщиной 0,75 мм) и пятно с 1% толуидина синий / буры (ТБ) в 50% -ном этаноле до рассмотрения световой микроскопии. 4. Статистический анализ Провести статистическую анализирует с помощью соответствующего пакета статистических программ. Двусторонний ANOVA с тестом после специальной Ньюмена-Keul может быть использована для расчета статистической значимости для IOP изменяется с течением времени. Значение р менее 0,05 может быть значительными.