Experimental Glaucoma induzida pela injeção de microesferas magnéticas Ocular

Declaração de Ética: Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com cuidado e uso Comitê de animal Institucional (IACUC), e foram aprovados de acordo com as diretrizes do Reino Unido Home Office ( http://goo.gl/FLkirW , acessado pela última vez a 10 de Junho de 2014) e da Declaração de ARVO para o Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research ( http://goo.gl/4LFOjD , acessado pela última vez dia 10 de junho de 2014). 1. Ocular Hypertension Indução Induzir glaucoma experimental, elevando a pressão intra-ocular (PIO) por meio de injecção unilateral de microesferas paramagnéticas para a câmara anterior de ratos Brown Norway, com base no método de Samsel et al. Outros 3 ratos pigmentados pode ser adequado, embora estes teriam de ser validado em primeiro lugar pelo utilizador. Casa 250-300 g femininoratos ex-criador Brown Noruega em um ambiente com pouca luz constante (40-60 lux) para minimizar flutuações diurnas em IOP 7, com acesso a comida e água ad libitum. Tome medidas de PIO basal em animais acordados 8 antes da anestesia e injeção talão, usando um tonômetro de rebote calibrado para uso no olho de rato 9. PIO é tomada como a média de cinco leituras. Anestesiar ratos com 37,5 mg / kg de cetamina e 0,25 mg / kg de cloridrato de medetomidina entregue intraperitonealmente. Confirme profundidade da anestesia, testando reflexos nos pés traseiros do animal, antes da aplicação de iodo povidona (veja o passo 1.5), e injeção de talão (veja o passo 1.8). Administrar 0,5% de cloridrato de proparacaína para analgesia. Nota: Não dilatar a pupila em qualquer fase. Isso vai ajudar as contas para resolver melhor no ângulo iridocorneal, e impedir a ligação à lente. Aplicar pomada ocular para evitar o ressecamento da córnea on-operado un olho contralateral. Wash o olho operativa com 5% de povidona iodo na água 10 5 min antes da injecção. Após 5 min, o pavio de iodo povidona fora com gaze estéril, e lavar o olho com solução salina estéril a 0,9%. Mantenha o olho úmido durante a anestesia com a aplicação regular de solução salina estéril. Coloque um ímã toroidal em torno do olho. Injecte 25 ul de uma solução contendo 30 mg / ml de gama-irradiação esterilizado 8 mm microesferas magnéticas em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) para a câmara anterior, usando uma agulha 33 G chanfrada. Para preparar os grânulos, lavagem por re-suspensão, seguida de centrifugação de 3 vezes a 10.000 xg durante 5 minutos com 1 ml de HBSS, antes de fazer a final / solução de 30 mg ml. Manter condições estéreis por toda parte. Para injecção, ter o cuidado de evitar a inserção da agulha para a íris, para minimizar o risco de trauma íris. Isto pode ser evitado por orientar a agulha tangente à superfície da córnea, como paralelaa íris possível. Isso também irá ajudar a minimizar a perda de talão do local da injeção. NOTA: Injectar pérolas a um ritmo acelerado para garantir uma distribuição uniforme em todo o ângulo iridocorneal, o que é fundamental para o aumento da pressão intra-ocular. Além disso, armazenar os grânulos, agulhas e anéis magnéticos separadamente, de modo que os grânulos não formarem aglomerados, o que os torna difíceis de carregar para dentro da seringa e injectar, e a agulha não se torna magnetizado. Deixar a agulha no lugar durante 1 min pós-injecção para assegurar que os grânulos resolver no ângulo iridocorneal para impedir a drenagem aquosa a partir da rede trabecular. Um pouco ângulo a agulha depois de as contas tenham estabelecido inicialmente para permitir algum vazamento do humor aquoso, para minimizar aumentos transitórios da pressão intra-ocular. No final da cirurgia, o expulsar através da agulha com o primeiro tampão de fosfatos salino (PBS), em seguida etanol a 70%, seguido por água destilada, para assegurar o uso continuado da agulha em procedimentos separados. Alternativamente, pode-se utilizaragulhas descartáveis, se a combinação correta de calibre e seringa está disponível. Opcionais: agulhas podem ser afiada usando um beveller para prolongar o seu uso. Nesta fase, se necessário, retire o ímã, e usá-lo para desenhar grânulos em áreas de cobertura incompleta. Deixe o ímã no lugar em torno do olho por mais 10 minutos após a injecção de assegurar contas de resolver bem no ângulo iridocorneal. Anestesia reversa usando 0,25 mg / kg de cloridrato de atipemezole. Administrar o cloranfenicol, ou outra pomada de antibiótico, por exemplo, gentamicina ou terramicina topicamente para evitar a infecção, e 0,5% de cloridrato de proparacaína para analgesia. Deixe os animais para se recuperar em uma esteira de calor até que recuperar o movimento, então a transferência para uma caixa quente e abastecimento com a nutrição adicional, como um suplemento alimentar ou dieta regular umedecido até a recuperação é completa. Analgesia sistêmica ou local deve ser dada aos animais que apresentam sinais de dor 24 horas após a cirurgia. Se these os sintomas persistirem apesar do tratamento, os animais devem ser humanamente abatidos. Use o olho contralateral como controle não operado. Efectuar as medições de IOP cada 2-3 dias após a administração do grânulo, e em seguida cada 2-3 dias utilizando um tonómetro rebote calibrado para utilização no olho de rato 9. Os critérios para a inclusão de olhos em estudos pode ser: se: 1) o IOP é elevada acima da pressão de controlo contralateral por 5 mmHg, e 2) não excede 60 mmHg. Olhos, onde a pressão de retorno à linha de base (normalmente de 1 semana de pós-injecção) não devem ser incluídos nos estudos, no entanto, é possível re-injectar grânulos em olhos que não conseguem desenvolver PIO elevada se desejado. Eutanásia animais por asfixia com CO 2 no final da experiência. Dissecar olhos e nervos ópticos, e fixar em 4% de paraformaldeído (PFA) durante a noite, para posterior análise histológica. 2. Avaliar Retinal Neuron Danos Utilizando TUNEL Staining Para quantificar células em apoptose em todo mount retinasuse o ensaio deoxynucleotidyl terminais mediada-transferase dUTP nick-rotulagem (TUNEL), de acordo com as instruções do fabricante. Dissecar a retina a partir da taça para os olhos, para lavagem de 3 x 5 min em 0,3% de Triton X-100 em solução salina de fosfato tamponada (PBS-T). Permeabilizar o tecido em 3% de T-PBS durante 2 h. Pré-equilibrar retinas em Tampão de Equilíbrio de 10 min, antes da incubação em solução de reacção TUNEL durante 1 hora a 37 ° C. Lave o tecido para 3 x 5 min em 0,3% T-PBS, lavar em 0,3% T-PBS contendo 5 mM DAPI, e flat-montagem em meios de montagem. Para quantificar TUNEL núcleos positivos usar um microscópio confocal para ter 10 mm z pilhas através da camada de células ganglionares com ampliação de 20x. Tome 3 imagens em cada uma das quatro pétalas, em locais próximos do nervo óptico, em meados da década de periferia, e na periferia longe da retina, dando um total de 12 imagens por toda Mount, a amostragem cerca de 7.000 células. Critérios morfológicos discriminados não neuronal (endotelial e da glia) células a partir de células neuronais. Selecionar áreas para imagens usando apenas o canal DAPI, e os investigadores de máscara para os grupos de tratamento. 3. Avaliação Optic Nerve Damage Usando Toluidine azul Coloração Fix nervos ópticos durante a noite em solução de Karnovsky a 4 ° C. Tratar as amostras durante 2 horas em 1% (w / v) de tetróxido de ósmio e, em seguida desidratar em etanol a 100%. Incubar nervos ópticos em óxido de propileno durante 30 min, e em colocar uma mistura de óxido de propileno de 50:50: durante a noite araldite. Alterar esta solução a 100% de araldite, seguido por incubação durante a noite a 60 ° C. Corte cortes semifinos seções (0,75 mm de espessura) e mancha com 1% de azul de toluidina / bórax (TB) em etanol a 50% antes do exame por microscopia de luz. 4. Análise estatística Realizar ana estatísticalisa usando um pacote de software estatístico adequado. A two-way ANOVA com teste post-hoc de Newman-Keul pode ser usado para calcular a significância estatística para IOP muda ao longo do tempo. Um valor de p inferior a 0,05 pode ser considerado significativo.