In Utero van intracardiale Tomaat-lectine Injecties op muis embryo's in te schatten nierdoorbloeding

Tijdens de embryonale ontwikkeling twee afzonderlijke, maar tegelijkertijd, vasculaire processen plaats: angiogenese, het proces waarbij een vat groeit uit een grote bestaande vat en vasculogenese, een de novo vorming van vaten uit residentiële endotheliale voorlopercellen ^1,2. Respectievelijk de vroegere synoniem bloedstroom, terwijl de laatste wordt gedacht grotendeels plaatsvinden in de afwezigheid ervan.

Gelijktijdig met de vorming van bloedvaten, begint een cyclisch en dynamisch proces nier voorlopercellen synthese, proliferatie en differentiatie te ontvouwen op embryonale dag 9,5 (E9.5). Op dit punt de ureterknop (UB) binnendringt dorsaal in omliggende metanefrische mesenchym (MM), en gaat door tot aan de geboorte ^3. Herhaalde vertakking van de UB in snel condenseren metanefros kap mesenchym begint de vorming van de functionele eenheden van de nier, het nefron. Bij elke nieuwe generatie van de UB en Nephron, zijn oudere generaties verplaatst naar innerlijke corticale en medullaire regio's, waar ze vervolgens ondergaan verdere rijping en differentiatie binnen voornamelijk vasculaire-dichte omgevingen. Zoals blijkt uit Dressler et al. ³ wordt dit embryologische proces neergeslagen door inductieve signalering, zoals overspraak tussen UB en MM en een groot aantal extracellulaire factoren ^3-6. Twee recent onderzocht extracellulaire factoren binnen de zich ontwikkelende alvleesklier en nieren bevatten zuurstofspanning en de bloedstroom ^7,8. Dit laatste zal nader worden besproken hieronder opzichte nierontwikkeling.

Om de inductieve rol die bloedstroom mogelijk speelt in nefron voorlopercellen differentiatie, en in andere processen organogenese, precieze en accurate werkwijzen embryonale bloedstroom mapping bloot is noodzakelijk.

Alternatieve methoden voor het meten van de bloedstroom omvatten het voorschrijven van ultrasound beeldvorming en hars werpt ^9,10. Overtuigend, zijn deze modi is aangetoond dat inherent ontbreken in hun vermogen om gelijktijdig te onthullen temporele en ruimtelijke tegenstellingen tussen de bloedstroom en stamcel differentiatie. Hars afgietsels, bijvoorbeeld een geldig model van het schip patroonvorming binnen volwassen weefsels, maar in onvolwassen schepen, zoals met embryonale tijdstippen, schepen zijn schromelijk onderontwikkeld en lekkende. Daarom hars werpt niet aan te houden binnen de kleine, vaak poreus, schepen.

Voor deze schijnbare hindernissen, onder anderen, hebben we gekozen om echogeleide in vivo intra-cardiale embryonale tomatenlectine (TL) micro-injecties in ons onderzoek van de ontwikkeling van de nieren te nemen. In deze procedure maken we gebruik van een ultrasone sonde om synchroon te begeleiden een gemonteerde micropipet naald gevuld met 2,5 ul van TL-oplossing in de linker ventrikel van de muis embryo's in E11.5, E13.5, E15.5 en E17.5 tijdstippen. E170,5 is de nieuwste ontwikkelingsleeftijd als de naalden zijn niet sterk genoeg om de meer ontwikkelde embryo doordringen.

De voordelen van deze micro-injectie werkwijze zijn overvloedig. Ultrageluid geleide microinjectie nauwkeurige plaatsing van een injectienaald in het embryonale linker ventrikel, passieve en gecontroleerde verwijdering van oplossing in het kloppende hart van het dier, minimale schade aan hart en omliggende weefsels, en het voorkomen van plotselinge hartfalen en dood van de embryo voorafgaand aan full-body perfusie. Bij het gebruik van een FITC-gelabelde TL zullen eventuele geperfundeerd vaatstelsel de marker langs de endotheliale apicale membraan behouden. In combinatie met immunohistochemie, gebruik PECAM (CD31, bloedplaatjes endotheelcel adhesie molecuul) en diverse andere vasculaire markers, kunnen we duidelijk onderscheid tussen geperfundeerde en niet-geperfundeerde schepen, alsmede karakteriseren elke afwijkende kleuring van omringende weefsels.