In Utero Intrakardiella Tomat-lektin Injektioner på musembryon att Gauge renala blodflödet

Under fosterutvecklingen två diskreta, men ändå samtidiga, vaskulära processer äger rum: angiogenes, den process genom vilken ett fartyg växer från en större befintligt kärl och vaskulogenes, vilket är en nybildning av kärl från bostäder endotel progenitorceller ^1,2. Respektive, är den tidigare synonymt med blodflödet, medan den senare tros till stor del äger rum i frånvaro av den.

Samtidig till blodkärlsbildning, en cyklisk och dynamisk process av njur stamcellstransplantation syntes, proliferation och differentiering börjar utvecklas på embryonala dag 9,5 (E9.5). Vid denna punkt i ureteric knoppen (UB) invaderar dorsalt i omgivande metanefrisk mesenkym (MM), och fortsätter fram till födseln ^3. Upprepade förgrening av UB in snabbt kondensera metanefrisk cap mesenkym börjar bildningen av de funktionella enheterna i njuren, nephron. Med varje ny generation av UB och Nephron, är äldre generationer förskjuts in inre kortikala och märg regioner, där de sedan genomgå ytterligare mognad och differentiering inom främst vaskulär-täta miljöer. Som framgår av Dressler et al. ^3, är detta embryologisk process påskyndades av induktiv signalering, såsom överhörning mellan UB och MM, och en myriad av extracellulära faktorer ^3-6. Två nyligen undersökta extracellulära faktorer inom utvecklings bukspottkörteln och njurarna inkluderar syrespänning och blodflöde ^7,8. Det senare kommer att diskuteras ytterligare i detalj nedan med avseende på njurutveckling.

För att exponera den induktiva roll som blodflödet spelar potentiellt i nefronet stamceller differentiering, liksom i andra organogenesen processer, exakta metoder för embryonal blodflöde kartläggning är absolut nödvändigt.

Alternativa metoder för att mäta blodflödet inkluderar förskrivning av ultrasound avbildning och harts casts ^9,10. Slutgiltigt, har dessa lägen visat sig vara inneboende saknas i deras förmåga att samtidigt presentera tidsmässiga och geografiska sammanställningar mellan blodflöde och stamcellsdifferentiering. Resin avgjutningar, till exempel, ger en giltig modell av fartyget mönstring inom vuxna vävnader, men i omogna fartyg såsom med embryonala tidpunkter, fartyg är grovt underutvecklade och läckande. Därför kastar harts misslyckas att hålla inom de små, ofta poröst, fartyg.

För dessa uppenbara hinder, bland andra, valde vi att införliva ultraljud-guidad in vivo Intrakardiella embryonala tomatlektin (TL) microinjections i våra undersökningar av njurutveckling. I detta förfarande använder vi en ultraljudssond att synkront styra en monterad mikropipett nål fylld med 2,5 ul av TL lösning in i den vänstra ventrikeln av musembryon vid E11.5, E13.5, E15.5 och E17.5 tidpunkterna. E170,5 är den senaste utvecklingsålder som nålarna är inte stark nog att penetrera mer utvecklade embryot.

Fördelarna med denna mikroinjektion metod är riklig. Ultraljud-guidad mikroinjektion möjliggör exakt positionering av en injektionsnål inom embryonala vänster kammare, passiva och kontrollerad utvisning av lösningen i att slå hjärtat av djuret, minimal skada på hjärtat och omgivande vävnader, och undvikande av plötslig hjärtsvikt och död embryo före hela kroppen perfusion. Med användning av en FITC-märkt TL, kommer varje perfusion vaskulatur bibehålla markör längs dess endotel apikala membran. I kombination med immunohistokemi, utnyttja PECAM (CD31, trombocyter endotelcellsadhesion molekyl) och diverse andra vaskulära markörer, har vi möjlighet att tydligt skilja mellan perfusion och un-perfusion fartyg, samt karakterisera något avvikande färgning av omgivande vävnader.