라이브 마우스의 직렬 내시경 이미징을 사용하여 소장 병변에 대한 새로운 치료제의 효능의 비 침습적 평가
Summary
We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.
Abstract
Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.
Introduction
대장 암 (CRC)은 악성 종양 전세계 1의 4 번째 가장 일반적인 원인이다. 이 질병의 가족 기초에 대한 우리의 이해에 상당한 진전에도 불구하고, 유전 적 소인은 CRC의 경우 2 ~ 20 %에 기여하고있다. 나머지는 만성 염증 등 다양한 외부 환경 요인에 기인한다. 인간에서 만성 염증과 대장 암 사이의 링크는 궤양 성 대장염 대장염 관련 대장 암 (CAC)을 개발하는 큰 위험을 가지고 (UC) 환자에 분명하다, 염증성 질환 (3)의 기간, 범위와 정도에 따라 -5. 따라서, 신규 한 치료법은 면역 반응 및 염증 종양 미세 환경에 의해 6-8 성장 촉진 인자 연관된 생산을 제어하는 발전에있다. 의 치료 효능을 특성화하기위한 적절한 전임상 동물 모델에 대한 증가하는 요구가있다개발 및 질병의 진행에 대한 이러한 약물.
마우스 모델은 명백히 염증 미세 환경에도 명백한 염증 9,10의 부재 하에서, CRC의 진행에 기여하고 있음을 증명하고있다. 이러한 모델은 상피 상해 및 급성 및 만성 염증성 장 질환 (IBD)을 모델링 11,12 마우스의 식수에 구비 다당류 덱스 트란 황산나트륨 (DSS)의 사용을 포함한다. DSS는 점막 손상 및 대장염을 유발하는 메커니즘이 완전히 이해되지는 않지만, 일부 연구 DSS가 셀들 내에 셀룰러 역전사 및 리보 뉴 클레아 활동을 저해하거나 결장 막이 손상 상피 선도 융합 나노 지질 복합체의 형성을 촉진하는 것이 시사 13, 14. 표준 DSS 모델에 대한 수정은 대장 상피 세포 조직의 항상성 및 regu을 유지하는 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다후반 점막 면역 반응 (15).
아족시 메탄 (AOM)의 복강 내 투여는 단독으로, 또는 DSS와 함께, 상피 점막 염증 및 간질 미세 환경 (16, 17)에 체세포 돌연변이 사이의 상호 작용을 조사하기위한 모델을 제공합니다. AOM 직접 DNA 돌연변이 발생하지 않습니다 발암 물질 1,2- 디메틸 하이드라진 (DMH)의 대사 산물이다. 대신, AOM은 MAM은 글루 쿠 론산과 접합하고 담즙 분비 부위 (18)를 통해 이송되어 간에서 시토크롬 이성체 CYP2E1 그래피 (MAM) methylazoxymethanol 가수 분해이다. 이것은 박테리아 β 글루 쿠로니다 아제는 DNA 알킬화 결과 MAM의 열화 19 상피 세포의 돌연변이의 축적에 기여하는 것으로 생각된다. 대부분 AOM 유도 결장 종양은 프로 테오 degradati에 내성 단백질 렌더링 코딩하는 유전자 β 카테닌의 과오 돌연변이 항구정식이 Wnt 신호 전달 경로 (20)의 비정상적인 활성화에 어떤 결과에. AOM의 활성에 의해 유발되는 DSS 점막 손상과 결합되면, 치유 반응 계속되는 돌연변이 된 상처가 상피 세포의 성장과 팽창에 도움이되는 미세 환경을 생성한다. 이 모델의 변형에서, 단독으로 몇 주에 걸쳐 AOM의 반복적 인 투여는 DSS 유도 10,17 대장염의 부재 하에서, 간헐적 인 대장 암을 모델링하는데 사용될 수있다. 이 두 가지 무료 모델은 염증성 종양 미세 환경 (10)과 관련된 두 가지 모두 각각 CAC 산발적 CRC를 연구하는 실험 설정을 제공합니다.
마우스에서 일련 내시경의 사용은 21 베커 동료가 개척 한 대장염 및 종양 진행의 길이 모니터링 할 수 있었다. 여기에서 우리는 DSS에 의한 점막 손상 및 / 또는 AOM 매개 TU에 따라 세 전임상 프로토콜을 제공MOR 유도 재현성 특정 대장 병변을 유도합니다. 첫 번째 프로토콜은 IBD와 관련된 조직 병리학 많은 기능을 유도하기 위해 DSS 관리에 대한 응답에서 급성 점막 손상을 유발 설명합니다. 제 2 프로토콜은 일반적 IBD 환자에서 관찰 된 염증의 플레어를 모방하는 DSS 투여 연속 3주기에 기초하고, AOM 유발 돌연변이와 함께 수행 될 수있다. 최종 프로토콜은 AOM에 의한 산발적 인 상피 돌연변이를 기반으로합니다. 이들 프로토콜 각각에 대해, 우리는 새로운 약물의 효능을 모니터링하도록 개발 예방 및 치료 적 중재 방법을 포함하는 관련 표준 절차에 대한 확장.
Protocol
Representative Results
Discussion
쥐에서 대장 질환 병리의 신뢰성과 재현성 유도의 개요 방법을 설명하는 세 가지 프로토콜을 지원합니다. 일상적인 내시경 모니터링 및 여기에 설명 된 중재 전략과 결합 할 때,이 프로토콜은 치료제의 효능에 강력한 전임상 통찰력을 제공 할 것입니다. 우리 연구소는 정기적으로 새로운 치료제 10,23,24의 성공을 모니터링하는 이러한 프로토콜을 모두 사용합니다.
전임상 동물 모델을 선택하는 새로운 치료제를 테스트 할 때 고려 사항들이있다. 이들은 인간 질병 모델의 관련성, 및 치료 대상의 동작 제안에 종양 미세 환경의 기여를 포함한다. 여기에서 우리는 설립 장내 질병 모델에서 치료 개입에 대한 세 가지 프로토콜을 제공합니다. 이러한 모델은 재현성과 질병을 유도하는 시약의 전달은 쉽게 관리 할 수 있습니다. 중요한 것은, 모델은 관련성이 높은여러 측면 및 대장염의 발병 및 종양 개시 및 진행 단계에. 연구진은 상당히 25 다를 수 있습니다 DSS 및 / 또는 AOM에 의해 유도 된 질병에 대한 감수성으로, 고려 실험을 설계 할 때 사용되는 마우스 균주의 유전 적 배경을해야합니다. 또한, 다른 미생물 군집은 세균에 의해 대사된다 AOM의 컨텍스트에서 다른 대사 능력을 가질 수있다. 우리는 하나의 실험에서 (상업 업체 포함) 다른 동물 시설에 태어난 쥐의 다른 동료를 사용에 대해 경고한다. 마찬가지로, 다른 시설에서 사용 된 생쥐에서 다른 미생물은 다른 호스트 응답이 각막 상피 손상 (11)을 유도 DSS에 유도 할 수 있습니다. 또한, (예를 들어, RNA 정화용) 조직의 적절한 분석은 후속 분석 26,27 분자에 영향을 역전사 효소를 억제하는 DSS의 능력 때문에, 고려되어야한다.
<p class = "jove_content"는> 마우스 내시경 반복 마우스 개체에서 질환 발병과 진행을 모니터링하는 최첨단 기술이다. 동영상을 녹화 및 정지 영상을 추출 할 수있는 능력은 여러 질병의 매개 변수와 종양의 쉬운 모니터링을 허용합니다. 동물 복지 향상에 더하여, 내시경 관찰하는 것은 전통적 질병 결과를 추적하기 위해 서로 다른 시간 지점에서 발췌 한 실험 쥐의 여러 코호트에 대한 필요성을 감소시킨다. MEICS 채점 시스템은 조직 병리학 적 분석을위한 대체 아니지만 대안 살아있는 쥐 동물 건강 및 점막 손상을 모니터링하는 수단을 제공한다. 마우스 내시경 전문 실험실 기술이며, 모든 절차는 마우스의 적절한 조작 및 처리를 보장하기 위해,뿐만 아니라 질병 득점에 사용되는 이미지의 일관성있는 품질을 제공하기 위해 숙련 된 기술자가 수행해야합니다. 자격을 갖춘 개인의 손에, 우리는 내시경 검사가 tumo에 거의 또는 전혀 손상을 유도하는 것을 발견했다내 종양 대 출혈을 야기 RS. 그것은 초기 종양 부담을 결정하는 수단을 제공하고, 치료 약물의 투여 이전에 유사한 종양 부담과 동물 군 코호트 우리 할 수 있으므로 약술 치료 프로토콜을 위해, 우리는, 내시경 매우 유리 고려한다. 마우스의 연속 모니터링은 적시에 실패한 실험을 종료하는 옵션을 사용하여 초기에 신규 치료법의 효능을 결정하기 위해 연구를 가능하게한다.염증성 장 질환과 대장 암 진행에 대한 우리의 이해로, 치료를위한 새로운 목표를 식별 할 수 있습니다. 적절한 동물 모델이 가장 유망한 새로운 치료법이 임상 시험을 향해 이동되는 것을 보장에 통합 될 것이다.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank CSL Ltd. for supporting the purchase of the endoscopy equipment. The research in the laboratory of ME is supported by the Ludwig Institute for Cancer Research, and the laboratories of TP and ME are supported by the Victorian State Government Operational Infrastructure Support and the National Health and Medical Research Council of Australia. ME is an NHMRC Senior Research Fellow.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dextran Sulfate Sodium (MW 36,000-50,000) | MP Biochemicals | 160110 | Requires batch testing. |
| Azoxymethane | Sigma | A5486-100MG | Requires batch testing. |
| Vanilla Protein Shake | N/A | N/A | Available from hospital pharmacies. |
| Isoflourane | PPC | M60303 | This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | Standard lab reagent. |
| Coloview miniendoscopic system | |||
| Endovision Tricam | Karl Storz | 20212001-020 | |
| Xenon 175 light source with anti-fog pump | Karl Storz | 20134001 | |
| HOPKINS straight Forward Telescope | Karl Storz | 64301AA | |
| Endoscopic Sheath (total diameter 3 mm) | Kalr Stroz | 61029C | |
| Fubre Optic Light Cable | Kalr Stroz | 69495ND | |
| Computer and media player software | MAC, imovies | ||
| Scale | Any | Any scale suitable for weighing mice. |
Referenzen
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