הערכה לא פולשנית של היעילות של ניו Therapeutics למעי פתולוגיות שימוש הדמיה אנדוסקופי סידורי של עכברים חיים
Summary
We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.
Abstract
Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.
Introduction
סרטן מעי גס (CRC) הוא הסיבה השכיחה ביותר 4 th של ממאירות בעולם 1. למרות ההתקדמות המשמעותית בהבנה של הבסיס המשפחתי של מחלה זו שלנו, נטייה גנטית תורמת רק ל~ 20% מהמקרים CRC 2. היתרה מיוחסת לגורמים חיצוניים וסביבתיים רבים, כוללים דלקת כרונית. בבני אדם, את הקשר בין דלקת כרונית וסרטן מעי גס ניכר בקוליטיס כיבית (UC) חולים, שיש להם סיכון גבוה יותר לפתח סרטן המעי הגס הקשורים קוליטיס (CAC), בהתאם לתקופה, של המחלה הדלקתית 3 המידה והחומרה -5. בהתאם לכך, טיפולים חדשניים בפיתוח לשלוט תגובה החיסונית והייצור הקשורים של גורמי גדילת קידום על ידי מייקרו-הסביבה של הגידול הדלקתי 6-8. יש דרישה הולכת וגוברת למודלים של בעלי חיים פרה-קליניים מתאימים לאפיין את היעילות הטיפולית שלתרופות אלו נגד ההתפתחות וההתקדמות של מחלה.
המודלים של עכברים באופן חד משמעי הוכיחו כי מייקרו-הסביבה הדלקתית תורם להתקדמות CRC, גם בהעדר של דלקת גלויה 9,10. מודלים אלה כוללים את השימוש של נתרן גופרתי dextran פוליסכריד (DSS), ובלבד במי השתייה של עכברים, לדגמן פגיעת אפיתל ומחלת מעי הדלקתי חריפה וכרונית (IBD) 11,12. למרות שהמנגנון שבאמצעותו DSS גורם נזק לרירית וקוליטיס אינו מובן לחלוטין, חלק מהמחקרים מצביעים על כך שDSS מעכב את פעילות transcriptase וribonuclease הפוכה סלולרית בתוך תאים, או מקדם את הקמתה של מתחמי ננו-שומנים שלהתמזג עם קרום המעי הגס מוביל לאפיתל נזק 13,14. גם שינויים במודל DSS הסטנדרטי סיפקו תובנה משמעותית המנגנונים שבאמצעותם תאי אפיתל במעי הגס לשמור על הומאוסטזיס וregu רקמהתגובה חיסונית ברירית מאוחר 15.
ממשל Intraperitoneal של azoxymethane (AOM) לבד, או בשילוב עם DSS, מספק מודל לבחינת יחסי הגומלין בין מוטציות סומטיות ברירית האפיתל ומייקרו-הסביבה הדלקתית וסטרומה 16,17. AOM הוא מטבוליט של קרצינוגן 1,2-dimethylhydrazine (DMH) שאינו ישירות לגרום למוטציות בדנ"א. במקום זאת, AOM הוא הידרוליזה לmethylazoxymethanol (MAM) על ידי איזופורם ציטוכרום CYP2E1 בכבד, שבו הוא MAM מצומדות עם חומצת glucuronic ולאחר מכן הועבר למעי דרך הפרשות מרה 18. הוא חשב כי β-glucuronidase החיידקים תורם לזילות של MAM וכתוצאה מכך אלקילציה DNA וההצטברות של מוטציות בתאי האפיתל 19. רוב הגידולים במעי הגס הנגרם AOM נמל מוטציות missense בגן המקודד β-קטנין, עיבוד החלבון עמיד לdegradati proteasomalב, שתוצאת ההפעלה חריגה של מסלול Wnt-האיתות הקנונית 20. כאשר הפעילות של AOM היא בשילוב עם הנזק לרירית שהושרו על ידי DSS, הפצע שהתפתח ריפוי תגובה יוצר מייקרו-סביבה כי הוא מסייע לצמיחה וההתרחבות של האפיתל mutagenized. בוריאציה של מודל זה, ממשל חוזר ונשנה של AOM על פני תקופה של מספר שבועות בלבד יכול לשמש מודל סרטן מעי גס סדיר, בהעדר קוליטיס המושרה DSS 10,17. שני דגמים מחמיאים אלה מספקים הגדרות ניסיוניות ללמוד CAC וCRC סדיר בהתאמה, שניהם קשורים למייקרו-סביבה של גידול פרו-דלקתי 10.
השימוש באנדוסקופיה הסידורי בעכברים היה חלוץ ידי בקר ועמיתים 21, ומאפשרת ניטור אורך של קוליטיס והתקדמות גידול. כאן אנו מספקים שלושה פרוטוקולים פרה-קליניים המבוססים על נזק הנגרם DSS הרירי ו / או tu תיווך AOMמור אינדוקציה לגרום reproducibly פתולוגיות מעי הגס ספציפיות. הפרוטוקול הראשון מתאר גרימת נזק לרירית חריפה בתגובה לממשל DSS לעורר רב של תכונות histopathological הקשורים במחל מעי דלקתי. הפרוטוקול השני מבוסס על שלושה מחזורים רצופים של ממשל DSS לחקות את הזיקוקים של דלקת נפוצה שנצפתה בחולים במחל מעי דלקתיים, ויכול להתבצע בשיתוף עם מוטציות הנוצר על-AOM. הפרוטוקול הסופי מבוסס על מוטציות אפיתל לא סדירות הנוצר על-AOM. עבור כל אחד מהפרוטוקולים הללו, אנו מרחיבים על הנהלים סטנדרטיים הרלוונטיים לכוללים שיטות התערבות מניעתית וטיפוליות שפיתחנו כדי לפקח על היעילות של תרופות חדשות.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלושה פרוטוקולים המתוארים שיטות קווי המתאר של אינדוקציה אמינה ושחזור של פתולוגיה מחלה במעי הגס בעכברים. בשילוב עם ניטור אנדוסקופית שיגרתי ואסטרטגיות ההתערבות שתוארו כאן, הפרוטוקולים הללו יספק תובנה פרה-קלינית חזקה ליעילותם של טיפולים. המעבדות שלנו משתמשות באופן שיגרתי כל פרוטוקולים אלה כדי לפקח על ההצלחה של תרופות רומן 10,23,24.
ישנם מספר שיקולים בעת בחירת מודל חיה פרה-קליני לבדיקת תרופות חדשות. אלה כוללים את הרלוונטיות של המודל למחלה האנושית, ואת תרומתם של מייקרו-הסביבה של הגידול לפעולה המוצעת של היעד הטיפולי. כאן אנו מספקים שלושה פרוטוקולים להתערבות טיפולית במודלי מחלת מעיים הוקמו. מודלים אלה הם שחזור והאספקה של חומרים כימיים כדי לגרום למחלה היא קלה לניהול. חשוב לציין, המודלים רלוונטיים מאוד להיבטים ושלבים של תחילת קוליטיס, וחניכת גידול ולהתפתחות מרובים. חוקרים צריכים לקחת בחשבון את הרקע הגנטי של זני העכבר משמשים בעת תכנון ניסויים, כמו הרגישות למחלות הנגרמת על ידי DSS ו / או AOM יכול להשתנות במידה ניכרת 25. בנוסף, ייתכן שיש לי קהילות חיידקים שונות יכולות חילוף חומרים שונות בהקשר של AOM, אשר עובר מטבוליזם על ידי חיידקים. אנו מזהירים מפני שימוש בקבוצות שונות של עכברים שנולדו לתוך מתקנים שונים של בעלי חיים (כוללים ספקים מסחריים) בניסוי אחד. באופן דומה, מיקרופלורת השונות בעכברים המשמשים ממתקנים שונים עשויים לעורר תגובת מארח שונה לDSS-Induced נזק מחסום האפיתל 11. יתר על כן, הניתוח המתאים של רקמה (לטיהור הדוגמא RNA) צריך להיות גם נחשב, שכן היכולת של DSS לעכב transcriptase ההפוך ישפיע על הניתוח מולקולרי הבא 26,27.
<p class = "jove_content"> אנדוסקופיה העכבר היא טכניקה חדשנית לניטור תחילת מחלה והתקדמות שוב ושוב בעכבר בודד. היכולת להקליט קטעי וידאו ולחלץ תמונות סטילס מאפשרת ניטור קל של פרמטרים מחלה מרובים וגידולים. בנוסף לשיפור רווחת בעלי חיים, ניטור אנדוסקופית גם מפחית את הצורך במחזורים רבים של עכברי ניסוי, אשר באופן מסורתי נלקחו בזמן נקודות שונות כדי לעקוב אחר תוצאות מחלה. שיטת הניקוד MEICS אינה מהווה תחליף לניתוח histopathological, אבל מספקת אמצעים חלופיים כדי לפקח על נזק בריאות בעלי החיים ורירי בעכברים חיים. אנדוסקופיה העכבר היא טכניקת מעבדה מיוחדת, וכל הנהלים צריכים להתבצע על ידי צוות מיומן כדי להבטיח מניפולציה וטיפול הולמות בעכברים, וכן כדי לספק איכות עקבית בתמונות המשמשות לניקוד מחלה. בידיו של אישית מוסמך, מצאנו כי אנדוסקופיה גורמת נזק מועט, אם בכלל tumors שיגרום לדימום תוך-tumoral. לפרוטוקולים הטיפוליים שתוארו, אנו רואים אנדוסקופיה יתרון מאוד, שכן הוא מספק דרך כדי לקבוע את נטל גידול הראשוני, ומאפשר לנו קבוצות קבוצה של בעלי חיים עם נטל גידול דומה לפני הממשל של תרופה טיפולית. ניטור רציף של העכברים מאפשר לחוקרים לקבוע את היעילות של טיפולים חדשניים בשלב מוקדם, עם האפשרות של הפסקת ניסויים מוצלחים במועד.כהבנה של מחלת מעי דלקתית וסרטן מעי גס שלנו מראש, מטרות חדשות לטיפול תזוהה. מודלים של בעלי החיים מתאימים יהיו חלק בלתי נפרד מהבטחה שהטיפולים החדשים המבטיחים ביותר מועברים לניסויים קליניים.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank CSL Ltd. for supporting the purchase of the endoscopy equipment. The research in the laboratory of ME is supported by the Ludwig Institute for Cancer Research, and the laboratories of TP and ME are supported by the Victorian State Government Operational Infrastructure Support and the National Health and Medical Research Council of Australia. ME is an NHMRC Senior Research Fellow.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dextran Sulfate Sodium (MW 36,000-50,000) | MP Biochemicals | 160110 | Requires batch testing. |
| Azoxymethane | Sigma | A5486-100MG | Requires batch testing. |
| Vanilla Protein Shake | N/A | N/A | Available from hospital pharmacies. |
| Isoflourane | PPC | M60303 | This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | Standard lab reagent. |
| Coloview miniendoscopic system | |||
| Endovision Tricam | Karl Storz | 20212001-020 | |
| Xenon 175 light source with anti-fog pump | Karl Storz | 20134001 | |
| HOPKINS straight Forward Telescope | Karl Storz | 64301AA | |
| Endoscopic Sheath (total diameter 3 mm) | Kalr Stroz | 61029C | |
| Fubre Optic Light Cable | Kalr Stroz | 69495ND | |
| Computer and media player software | MAC, imovies | ||
| Scale | Any | Any scale suitable for weighing mice. |
Referenzen
- Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10, 353-358 (2009).
- Rustgi, A. K. The genetics of hereditary colon cancer. Genes Dev. 21, 2525-2538 (2007).
- Rutter, M., et al. Severity of inflammation is a risk factor for colorectal neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 126, 451-459 (2004).
- Eaden, J. A., Abrams, K. R., Mayberry, J. F. The risk of colorectal cancer in ulcerative colitis: a meta-analysis. Gut. 48, 526-535 (2001).
- Lakatos, P. L., Lakatos, L. Risk for colorectal cancer in ulcerative colitis: changes, causes and management strategies. World J Gastroenterol. 14, 3937-3947 (2008).
- Xiang, B., Snook, A. E., Magee, M. S., Waldman, S. A. Colorectal cancer immunotherapy. Discov Med. 15, 301-308 (2013).
- Feng, Q. Y., et al. Anti-EGFR and anti-VEGF agents: Important targeted therapies of colorectal liver metastases. World J Gastroenterol. 20, 4263-4275 (2014).
- Dinarello, C. A. Anti-inflammatory Agents: Present and Future. Cell. 140, 935-950 (2010).
- Grivennikov, S. I., et al. Adenoma-linked barrier defects and microbial products drive IL-23/IL-17-mediated tumour growth. Nature. 491, 254-258 (2012).
- Putoczki, T., Thiem, S., Loving, A., Busuttil, R. A., Wilson, N. A., Ziegler, P., Nguyen, P., Preaudet, A., Farid, R., Edwards, K., Boglev, Y., Luwor, R. B., Jarnicki, A. J., Horst, D., Boussioutas, A., Heath, J., Sieber, O., Nash, A., Greten, F., McKenzie, B. S., Ernst, M. Interleukin-11 is the dominant IL-6 family cytokine during gastrointestinal tumorigenesis and can be targeted therapeutically. Cancer Cell. 24, 257-271 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
- Rose, W. A., Sakamoto, K., Leifer, C. A. Multifunctional role of dextran sulfate sodium for in vivo modeling of intestinal diseases. BMC Immunol. 13, 41 (2012).
- Laroui, H., et al. Dextran sodium sulfate (DSS) induces colitis in mice by forming nano-lipocomplexes with medium-chain-length fatty acids in the colon. PLoS One. 7, e32084 (2012).
- Miyazawa, F., Olijnyk, O. R., Tilley, C. J., Tamaoki, T. Interactions between dextran sulfate and Escherichia coli ribosomes. Biochim Biophys Acta. 145, 96-104 (1967).
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14, 141-153 (2014).
- Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nat Protoc. 2, 1998-2004 (2007).
- Schwitalla, S., et al. Loss of p53 in Enterocytes Generates an Inflammatory Microenvironment Enabling Invasion and Lymph Node Metastasis of Carcinogen-Induced Colorectal Tumors. Cancer Cell. 23, 93-106 (2013).
- Fiala, E. S. Investigations into the metabolism and mode of action of the colon carcinogens 1,2-dimethylhydrazine and azoxymethane. 40, 2436-2445 (1977).
- Chen, J., Huang, X. F. The signal pathways in azoxymethane-induced colon cancer and preventive implications. Cancer Biol Ther. 8, 1313-1317 (2009).
- Bollrath, J., et al. gp130-mediated Stat3 activation in enterocytes regulates cell survival and cell-cycle progression during colitis-associated tumorigenesis. Cancer Cell. 15, 91-102 (2009).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1, 2900-2904 (2006).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139, 485-498 (2009).
- Thiem, S., et al. mTORC1 inhibition restricts inflammation-associated gastrointestinal tumorigenesis in mice. J Clin Invest. 123, 767-781 (2013).
- Stuart, E., et al. Therapeutic inhibition of Jak activity inhibits progression of gastrointestinal tumors in mice. Mol Cancer Ther. 13, 468-474 (2014).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9 (2011).
- Viennois, E., Chen, F., Laroui, H., Baker, M. T., Merlin, D. Dextran sodium sulfate inhibits the activities of both polymerase and reverse transcriptase: lithium chloride purification, a rapid and efficient technique to purify RNA. BMC Res Notes. 6, 350 (2013).
- Kerr, T. A., et al. Dextran sodium sulfate inhibition of real-time polymerase chain reaction amplification: a poly-A purification solution. Inflamm Bowel Dis. 18, 344-348 (2012).
