Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

HINWEIS: Die beschriebenen wurde vom Institutional Review Board der Wake Forest School of Medicine genehmigten Protokoll. Eine Einverständniserklärung wurde schriftlich erhalten. Alle Teilnehmer waren gesunden älteren Erwachsenen (65-79 Jahre) beider Geschlechter, mit BMI zwischen 23-35. 1. Skelettmuskelbiopsie Wie zuvor beschrieben, 9 führen alle Biopsien am frühen Morgen, nachdem ein A / N schnell. Fragen Sie die Themen, zum von Aspirin, verschreibungspflichtigen und OTC-the-counter-nicht-steroidale entzündungshemmende Medikamente oder andere Verbindungen, die Blutungen, Blutplättchen oder Blutergüsse in der Woche vor der Biopsie beeinflussen können unterlassen. Bitten Sie die Teilnehmer auch von jeder anstrengenden Tätigkeit zu enthalten mindestens 36 Stunden vor der Biopsie. HINWEIS: Muscle aus dem Vastus lateralis erhalten mit dem perkutanen Nadelbiopsie Technik mit einem perkutanen Nadel unter Lokalanästhesie mit 1% Lidocain. Keine medizinische Komplikationen oder other berichteten Nebenwirkungen von dem Verfahren wurden in unserem klinischen Forschungseinheit aufgetreten. HINWEIS: Die beschriebene Biopsieprozedur wird von der Bergstrom 10 ausgelegt. Kurz gesagt, lokal zu verabreichen 1% Lidocain kümmert sich nicht um den Muskel zu infiltrieren. Befolgen Sie diese mit einem 10 Minuten Wartezeit, um eine ausreichende Betäubung ermöglichen. Nehmen Sie die Biopsien aus dem Bauch des Muskels (der mittlere Bereich des Muskels zwischen Ein- und Herkunft) zu vermeiden subfaszialen und myotendonous Bereichen. Verwenden perkutane Nadel (eine Saugwirkung unterstützt wiederverwendbaren Gerät mit einem Seitenschneider Fenster und Innenschneidzylinder) und folgen einer Faszien "Pop" oder Widerstand der Faszie als Leitfaden. Schätzen Sie die Tiefe der Anästhesie Nadel, dann wieder das Gefühl, es mit der schmalen Skalpell und eine 4-5 mm Schnitt durch die Faszie. Die Kanüle durch den Einschnitt, bis es in den Muskel eingeführt wird. Sammelnmehrere Proben mit dem Fenster gedreht in verschiedenen Richtungen. Bewerben Dauersog mit einem 60-ml-Spritze beim Vorrücken und Zurückziehen Muskelproben in die perkutane Nadel zwei bis vier Mal in verschiedene Richtungen. Unterbrechen Sie die Saug- und entfernen Sie die Nadel. HINWEIS: Jeder Durchlauf (Einsetzen und Entfernen der Nadel) weniger als eine Minute. Einen Assistenten anwenden festen Druck auf Website Punktion für 5 Minuten, um eine Hämostase zu etablieren. Trennen Nadel aus Saugschlauch und entfernen Sie vorsichtig Muskelproben aus dem Fenster und Zylinder. Einen zweiten Durchgang, wenn mehr Muskel wird durch Wiederholen des obigen Verfahrens benötigt. Entfernen Sie alle sichtbaren Blutgerinnseln aus der Muskelprobe mit einer Pinzette, wiegen die Probe, und sofort in ein Röhrchen mit eiskaltem DPBS platzieren. HINWEIS: Der Durchschnittsertrag mit dieser Methode ist 150 ± 20 mg. 2. Mitochondriale Isolation <ol> Frisch bereiten die Chappel-Perry (CP) und mitochondriale Assay-Lösung (MAS) Puffer (Tabelle 1) am Tag des Experiments oder aliquotieren und lagern Sie sie bei -20 ° C. Bereiten Sie die Verbindungen in Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 2,5 mM und aliquote und bei -20 ° C. Verwenden Sie die bei -20 ° C innerhalb von 2 Monaten ab dem Tag der Vorbereitung gespeicherten Puffer und Verbindung Aliquots. Sichtbare Bindegewebe aus der Probe mit einer scharfen Schere und Pinzette; Bei Bedarf Verwendung eines Binokular für diesen Schritt. Gründlich waschen Proben 3-4 mal mit eiskaltem DPBS-Puffer, um Blut zu entfernen. Bewahren Sie die Proben auf eiskaltem DPBS und Verfahren so schnell wie möglich, dabei mehr als 45 Minuten von Biopsie nicht zu überschreiten. Nehmen Sie vorsorglich sorgfältig entfernen Sie alle Sehnen oder Fettgewebe von der Muskelprobe. Unmittelbar hacken Muskelgewebe in feine Stücke mit einer sterilen Schere und Aussetzung in 500 ul zu 1 ml enthält CPI proteinase (Nagarse) in einer Konzentration von 0,2 mg / g Gewebe. Folgen Sie dieser mit einer 5-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur und dann in Eis zu übertragen. Homogenisieren Hackfleisch Gewebe mit Nagarse behandelt unter Verwendung eines automatischen Homogenisator. Halten Sie die Probe auf Eis während des gesamten Prozesses. Homogenisieren jeder Gewebeprobe vier Mal, jedes Mal für einen Impuls von 2 sec, unter Verwendung des automatisierten Homogenisator bei einer Geschwindigkeitseinstellung von 10.000 Upm. Waschen Sie die Sonde mit 70% Ethanol, gefolgt von destilliertem Wasser zwischen Geweben. Mit einem gleichen Volumen von CP I (500 & mgr; l bis 1 ml) und 2x Volumen CP II (1 ml bis 2 ml) waschen des homogenisierten Gewebes und sammeln sich die Inhalte in ein Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 600 × g, 4 ° C für 10 min. Übergeben Sie den Überstand durch ein Käsetuch benetzt, das Filtrat und entsorgen Sie den Pellet und damit die Mehrheit der nicht-mitochondriale Fraktionen zu entfernen. 3. Waschen der Mitochondrien Zentrifugieren Sie den Überstand aus dem obigen Schritt 10,000 × g, 4 ° C für 10 min. Suspendiere das Pellet in 4 ml CP-Puffer II und weitere Zentrifuge bei 10.000 × g, 4 ° C für 10 min. HINWEIS: In seltenen Fällen wird eine dünne Pellet von Blut unter der mitochondrialen Pellet geformt. In diesem Fall nehmen Sie die mitochondriale Pellet durch vorsichtiges Ansaugen mit CPII Puffer. Dieser Schritt kann durch gründliches Waschen entfernt Blut in Schritt 2 vermieden werden. Hängen Sie das in 2 ml CP I Puffer erhaltenen Pellets. In dieser Phase mit einem kleinen Aliquot dieser Suspension für die Proteinschätzung. Resuspendieren die verbleibende Probe in CP I wie oben Puffer und Zentrifuge. Suspendiere das endgültige Pellet in einer minimalen Menge (200 ul) der mitochondrialen Assaylösung (MAS). HINWEIS: Das Protein wird in dieser Phase untersucht, da CP I Puffer keine BSA, während MAS in dem die Proben später ausgesetzt werden muss haben BSA darin. 4. Schätzen Sie die Mitochondrial Inhalt von Messproteinkonzentration unter Verwendung eines BCA Protein Assay Kit <pclass = "jove_content"> Hinweis: Nutzen Sie diese Konzentration, die Menge der Mitochondrien für das Laden verwendet, auf eine 24-Well-Mikroplatten für respirometrischen Messungen oder für Western-Blot-Experimenten berechnen. Berücksichtigen Sie den Verdünnungsfaktor (10) zur Berechnung der Proteinkonzentration. 5. Führen Sie die XF-Assays wie von Rogers, GW et al. 12 HINWEIS: Visualisieren der O 2 Verbrauchsrate (OCR) in pMol O 2 / min oder absoluten Werte von O 2 und pH-Wert in dem Datenausgang. Verwenden 1x MAS um Verbindungen herzustellen, die injiziert werden. Fügen Sie einen 10x Konzentration der Verbindungen auf die Ports AD, um eine Endkonzentration geben wie folgt: Anschluss A, ADP [Adenosin 5 '-diphosphate, 2 mM, 50 ul]; Port B, Oligomycin (2 & mgr; M, 55 & mgr; l); Port C, FCCP [Carbonylcyanid 4- (Trifluormethoxy) Phenylhydrazon, 6 & mgr; M 60 ul]; und Port D, 2 uM Antimycin-A (65 ul). Bereitenausreichendes Volumen von Verbindungen für die erforderliche Anzahl von Vertiefungen. Die Ermittlung der optimalen Menge an Mitochondrien durch Titration. Zum Beispiel maximal 1,0 ug, 2,5 ug und 5,0 ug Mitochondrien pro Vertiefung in einer 50-ul-Volumen eiskaltem 1x MAS enthaltenden Substrat. Um die Variabilität zwischen den Wells zu minimieren, zunächst verdünnen 10x Mitochondrien in kaltem 1x MAS + Substrat. Anschließend liefern 50 ul dieser Suspension in jede Vertiefung (mit Ausnahme der Untergrundkorrektur Brunnen). Zentrifugieren Sie die Platte bei 2.000 × g, 20 min bei 4 ° C. Nach dem Zentrifugieren vorsichtig mit 450 ul 1x MAS + Succinat (10 mM) und Rotenon (2 uM) (Anfangsbedingungen, siehe unten) in jede Vertiefung. Die Mitochondrien unter dem Mikroskop sehen homogene Festhalten an der auch vor der Übertragung der Platte an der XF-Analysator zu gewährleisten. HINWEIS: Die verwendeten davon ab, ob die Atmung wird entweder durch ETC-Komplex I oder komplexe II gefahren abhängt Anfangsbedingungen. Für komplexe II gesteuerte Beatmung, mit succinate (10 mM) und Rotenon (2 & mgr; M) als Anfangsbedingungen. Rotenon Blöcke Komplex I und Succinat liefert Brennstoff für komplexe II (Succinatdehydrogenase). Die Atmung von Komplex I angetrieben studieren, verwenden entweder Pyruvat und Malat, jeweils bei einer Endkonzentration von 5 mM oder Glutamat und Malat jeweils bei einer Endkonzentration von 10 mM als Anfangsbedingungen. Letzteres kann bei der Unterscheidung Dysfunktion bei Tricarbonsäurezyklus und Substrat-Transport zu helfen. Atmung sowohl Komplex I und komplexe II angetrieben zu studieren, sind Pyruvat und Succinat ohne Rotenon oder Malat als Anfangsbedingungen. Verwenden Palmitoylcarnitin als ein Substrat für β-Oxidation. Nacheinander messen die mitochondriale Atmung in Echtzeit mit Hilfe der Respirometer durch Programmierung es wie zuvor beschrieben 12. Verwenden Sie die Einstellungen für die Respirometer in Tabelle 2 bereitgestellt. HINWEIS: Eine kurze Erläuterung der verschiedenen mitochondrialen Atmung Zustände sind wie folgt: <li> State 2 = gekoppelten Zustand mit vorhandenen Substrat; Zustand 3 = Phosphorylieren Atmung in Gegenwart sättigender ADP; Zustand 4 o = nicht-Phosphorylierung Atmung durch Oligomycin induziert; Staats 3u = maximale abgekoppelt Atmung durch den Entkoppler FCCP stimuliert; Rest nicht-mitochondriale Atmung = Atmung nach komplexen III Hemmung durch Antimycin-A. Es sollte auch darauf hingewiesen werden, dass die Länge des OCR-Messung in Kombination mit der mitochondrialen Konzentration konnten die Angaben abbau Sauerstoff während der Messzeiträume zu beeinflussen. 6. Western Blot HINWEIS: Legen Sie die mitochondriale Marker COX IV und ganze Gewebe GAPDH durch Western-Blotting, um die Anreicherung von Mitochondrien in die endgültige Stichprobe zu gewährleisten Trenne die isolierten Mitochondrien und ganze Gewebeextrakt von 12% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelen. Transfer der Proteine ​​auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membran. Inkubieren mit COX IV-Antikörper (1: 20.000), gefolgt von Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugierten sekundären Antikörpern. Für GAPDH Bestimmung, Streifen der Blot und Sonde mit einer GAPDH monoklonalen Antikörper (1: 2000). HINWEIS: Wenn Unterschiede in der ER Kontamination von Belang sind, umfassen ER Marker wie ERp72, Calnexin, Calreticulin oder in der Analyse.