Die Isolierung der einzelnen Dopamin-Neuronen oder der ventralen Haubengebiet mit direkter oder indirekter Immunhistochemie nutzt Laser Mikrodissektion demonstriert. Parameter für die Isolierung von Gewebe aus einem Glasobjektträger unter Verwendung eines Infrarotlasers und aus Membran Folien unter Verwendung der Kombination eines Infrarot und Ultraviolett-Lasers diskutiert.
Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) verwendet wird, um eine konzentrierte Population von Einzelzellen oder präzise anatomische Regionen von Gewebe aus Gewebeabschnitte auf einem Objektträger zu isolieren. Wenn mit Immunhistochemie kombiniert, LCM verwendet, um einzelne Zelltypen, basierend auf einem spezifischen Proteinmarker isolieren. Hier wird das LCM-Technik zum Sammeln einer spezifischen Population von Dopamin-Neuronen direkt mit Tyrosinhydroxylase Immunhistochemie und zur Isolierung des Dopaminneurons Bereich des ventralen tegmentalen Bereich mittels indirekter Tyrosinhydroxylase Immunhistochemie auf einem Abschnitt benachbart zu den für LCM verwendet enthaltenden markierten beschrieben. Ein Infrarot (IR) Lasererfassung wird sowohl verwendet sezieren einzelnen Neuronen sowie die ventrale Tegmentum aus Glasobjektträger und auf eine LCM Kappe für die Analyse. Vollständige Dehydratisierung des Gewebes mit 100% Ethanol und Xylol, ist kritisch. Die Kombination aus dem IR Erfassungslaser und der ultravioletten (UV) cutting Laser verwendet, um einzelne Dopamin-Neuronen oder die ventralen Haubengebiet bei der Verwendung von PEN-Membran gleitet isolieren. Ein PEN Membran Schieber signifikante Vorteile gegenüber einem Glasträger, wie sie bessere Konsistenz in Erfassen und Sammeln von Zellen, schneller sammeln große Gewebestücke, weniger abhängig von Dehydratisierung und führt zu einer vollständigen Entfernung des Gewebes aus der Folie. Obwohl die Entfernung von großen Flächen von Gewebe aus einem Glasobjektträger möglich ist, ist es wesentlich zeitaufwendig und häufig lässt etwas Restgewebe hinter. Hier gezeigten Daten zeigen, dass RNA in ausreichender Menge und Qualität lassen sich mit diesen Verfahren für die quantitative PCR-Messungen gewonnen werden. Obwohl RNA und DNA sind die am häufigsten isolierten Moleküle von Gewebe und Zellen mit LCM, Isolierung und Messung von Mikro-RNA, Proteine und epigenetische Veränderungen in der DNA gesammelt kann auch von der verbesserten anatomischen und zellulärer Auflösung profitieren unter Verwendung von LCM.
Alle Gewebe aus einem heterozygoten Population von Zellen. Dies ist für die Gehirngewebe besonders relevant, die aus verschiedenen morphologisch und / oder neurochemisch unterschiedlichen Neuronen durch verschiedene Arten von Gliazellen (Oligodendrocyten, Mikroglia und Astrozyten) umgeben ist. Zusätzlich unterschiedliche Bereiche im Gehirn, wie beispielsweise Teile des Kortex oder Hirnstammkernen haben spezifische Funktionen. Daher ist die Möglichkeit, bestimmte Zellpopulationen oder sehr kleine anatomisch verschiedene Bereiche zu isolieren, wenn sie mit Analysetechniken (dh Q-PCR, Microarrays, RNA-Sequenzierung und Proteomics) kombiniert wird, kann deutlich Verbesserung des Verständnisses der verschiedenen biologischen Prozessen. LCM ist eine Technik, die Fähigkeit, sehr diskreten anatomischen Bereiche oder spezifischen Zellen von Gewebe auf einem Objektträger die eine viel homogenere Quelle für die weitere Analyse verschiedener Moleküle, wie RNA, MikroRNA, DNA und Proteine zu isolieren, bietet.
t "> Da LCM zuerst eingeführt wurde, wurden verschiedene Ansätze verwendet worden, um Zellen aus Gewebe 1-3 microdissect. Die frühesten Ansätze beinhalteten die direkte Befestigung von Gewebe auf einem Objektträger unter Verwendung eines Infrarot (IR) -Laser und einen thermoplastischen Film und einem nicht- Kontaktverfahren unter Verwendung eines Ultraviolett (UV) Laserschneiden, eine Zelle oder ein Gewebe und Sammlung in ein Rohr zu lösen. Anschließend LCM wurde erfolgreich auf eine Vielzahl von Geweben und Zelltypen verwendet, und es wurde gezeigt mit Isolierung verschiedener Moleküle für nachgeschaltete Analyse kompatibel ist einschließlich RNA, MikroRNA, DNA und Proteine, einschließlich enzymatischer Aktivität 1,4-7. Hier wird unter Verwendung des LCM ein LCM-System, die eine Schneid UV-Laser und einen Fang IR Laser zum Schneiden um Zellen oder Gewebe und Anhängen an eine nutzt nachgewiesen LCM Kappe verbunden. verwendet diese LCM Systems sowohl die IR Erfassungslaser, einen Kunststofffilm auf einer Kappe über die Zelle oder das Gewebe von Interesse, dass die Zellen an der Kunststofffolie befestigt und entfernt sie aus t schmelzener Gewebes mit der Entfernung der Kappe (1). Zusätzlich kann in Verbindung mit dem IR-Laser, ein UV-Laser ist, um ausgeschnittene Gewebe oder Zellen von Interesse von Gewebe auf Objektträgern mit einer Membran anschließend durch Befestigen des Gewebes auf die LCM Kappe unter Verwendung der IR-Laser (2) isoliert angeordnet ist. Ein kurzer Überblick über diese Techniken wird in den 1 und 2 gefunden.Mehrere Variationen dieser Technik werden beschrieben, um entweder Isolieren spezifischer Zellen mittels direkter Fluoreszenz-Immunhistochemie und eine indirekte Immunhistochemie geführte Technik, die für die Isolierung von einem Bereich des Gewebes basierend auf der Expression eines bestimmten Proteins verwendet wird. Insbesondere wird die Isolierung von Dopamin-Neuronen der Substantia nigra und Isolierung des ventralen tegmentalen Bereich und die anschließende Isolierung von RNA aus frischem, gefrorenen Gehirngewebe gezeigt. RNA ist die labile Moleküle gemessen (im Vergleich zu DNA oder Protein), steps zur Erhaltung der Integrität der RNA enthalten sind und Daten über die Menge und die Qualität der RNA erhalten angezeigt.
LCM ist eine leistungsfähige Technik für die Präparation von diskreten Populationen von Zellen oder Gewebebereiche von Gewebeschnitten auf einem Objektträger und die anschließende Isolierung von RNA, MikroRNA, DNA und Proteinen. Die Verwendung von LCM in Verbindung mit der Analyse unter Verwendung von Hochdurchsatz-Technologien wie Mikroarray, der nächsten Generation RNA-Sequenzierung, epigenetische Analyse von DNA und Proteomik wird mehr und mehr üblich, die Empfindlichkeit dieser Verfahren verbessert und die Menge des benötigten Ausgangsmaterials wird reduziert 8-12. Mit LCM wird eine bessere anatomische Auflösung für eine Probe erreicht, und das Verständnis von nachgeschalteten Maßnahmen dieser Proben wesentlich verbessert. Eine Einschränkung mit LCM ist, dass es eine konzentrierte Probe der Zellen von Interesse, aber nicht notwendigerweise eine reine Population von Zellen. Die Grenzen der Präzision, dass es eine gewisse Kontamination von benachbarten Gewebe sein. Allerdings ist diese Technik zu konzentrieren, die Zellen von InteresseEffekte mit dem umgebenden Gewebe und Zellen zu minimieren und die experimentellen Effekte auf die Zellen von Interesse.
Direkte versus indirekte Immunhistochemie
Seit LCM wird derzeit vor allem für die Isolierung und Messung von RNA verwendet werden, halten RNA intakt ist ein sehr wichtiges Kriterium. Aufrechterhalten RNA Integrität ist das Hauptprinzip hinter der Verwendung indirekter Immunhistochemie Gewebedissektion, die die Notwendigkeit, das Gewebe direkt zu färben, die die RNA abbauen kann entfernt führen (Abbildung 10). Wenn die experimentellen Frage jedoch erfordert die Isolierung einer Population von Zellen, wie beispielsweise Dopamin-Neuronen, wird direkte Fluoreszenz Immunhistochemie erforderlich. Verwendung eines schnellen Immunhistochemie Markierungsprotokoll kann den Abbau der RNA während des Verfahrens zu minimieren. Aufgrund der Verwendung von hohen Konzentrationen an primären und sekundären Anti die kurzen InkubationszeitenKörper, Konzentrationen, die um 10 bis 20 mal höher sind als das, was für konventionelle Immunhistochemie mit einer 2-stündigen Inkubation notwendig ist. Wenn jedoch längere Inkubationszeiten erforderlich sind, Brown und Smith verwendet Hochsalzpuffer, um RNA-Abbau hemmen und erhalten gute Qualität RNA mit langen Inkubationszeiten (bis zu 20 h) 13. Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, wenn es beträchtliche Zeit zwischen Kennzeichnung des Gewebes und Zugriff auf einen LCM Systems erforderlich.
Wahl der Folien – PEN-Membran, Silan-prep und unbeschichteten Glasträger
Die Verwendung von unbeschichteten Glasträger für LCM berichtet worden 14. In unserem Labor haben Silane-Prep-Folien wurde gefunden, dass die optimale Wahl, da diese Beschichtung ausreichend befestigt das Gewebe auf dem Objektträger für die Immunhistochemie, ohne Verlust von Gewebe erlaubt aber für die Befestigung des Gewebes an den LCM Kappen und der Entnahme aus dem Schlitten . Unbeschichtete Glasobjektträger habenzeigte einige Gewebeverlust mit dem immunhistochemischen Verfahren. Wenn indirekten Immunhistochemie verwendet wird, wird jedoch Gewebeerhalt weniger ein Problem. Mit der richtigen Wasserentzug, die Erfassung von Zellen oder Gewebe aus Silan-Prep-Folien war nicht ein Problem. Jede der verschiedenen Ansätze für die in diesem Dokument beschriebenen Isolierung Neuronen oder Hirnregionen hat Vorteile und Nachteile. Zur Isolierung der einzelnen Dopamin-Neuronen, die Verwendung von Silan-prep Folien hat den Vorteil einer besseren Optik und ist weniger teuer als die PEN Membran gleitet. Der Nachteil ist, dass manchmal die Erfassung Zellen schwierig sein kann, wenn nicht genügend Dehydratisierung (siehe unten) und einige Gewebe kann auf der Folie verbleiben. Der Vorteil der PEN Membranen Folien besteht darin, dass mit der Kombination aus dem Laser und UV-Laser IR sichergestellt, dass die Dopamin-Neuronen werden gesammelt. Nicht Zellen aus einem PEN-Membran gleitet sammeln fast nie auftritt, da es weniger abhängig von Austrocknung als die Glasobjektträger ist. Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass die UV-Laser verwendet werden kann, um die Form der Neurone von Interesse enger anzunähern, als im Vergleich zu einem Kreis zur Erfassung von Neuronen aus der Glasobjektträger mit dem IR-Laser. Für die Isolierung von Gewebebereiche sind die PEN-Membran-Folien weit überlegen und rechtfertigen die zusätzlichen Kosten. Dieser Ansatz führt zu einer vollständigen Entfernung des gesamten Gewebes auf die Membran geschnitten wird, ist viel schneller als die Erfassung einen großen Bereich von Gewebe unter Verwendung des IR-Laser allein und dickere Gewebeabschnitte gesammelt werden können. Nur unter Verwendung der IR-Laser erfordert, dass das LCM Kappenmembran vollständig über den gesamten Gewebebereich aufgeschmolzen. Darüber hinaus ist unvollständige Sammlung des Gewebes typischen und erfordert in der Regel mehrere Versuche. Obwohl diese länger als Trenngewebe aus dem PEN Membran Rutsche, ist, wenn die verfügbare Gewebe ist bereits auf einem Glasträger oder einem UV-Laser nicht verfügbar ist, ist dies eine gangbare Option, da die meisten Gewebe gesammelt werden können (Figur 8J).
ove_content "> Kritische SchritteDie 100% Ethanol Inkubationen sind eine der wichtigsten Schritte. Um Zellen aus Silan-prep gleitet sammeln vollständige Dehydratisierung des Gewebes erforderlich ist. Deshalb wird jede Wasser nicht entfernt, die vor allem mit der 100% Ethanol Inkubation verbunden ist, beeinflussen die Fähigkeit zu holen Zellen aus den Folien. Um dieses Problem zu beheben, ändern sich häufig die 100% Ethanol-Lösungen wie Wasseraufnahme aus der Luft oder die Übertragung der letzten Waschschritten kann die Entwässerung beeinflussen. Zusätzlich werden Molekularsiebe verwendet, um jede Wasserverschmutzung zu absorbieren. Die LCM-System sollte idealerweise in einem kleinen Raum mit einem Entfeuchter zu niedriger Luftfeuchtigkeit zu halten sein.
Gute Kryostatschnitten sind entscheidend für die richtige LCM. Bereiche müssen flach mit Falten im Gewebe minimiert werden. Falten in dem Gewebe wird die Entfernung zwischen dem LCM Kappe erhöhen und verhindern, dass es in Kontakt ter Gewebe. Es wird dann schwierig, die Membrankappe auf das Gewebe ausreichend zu schmelzen. Für Glasträger, typischerweise Schnittdicke sollte zwischen 6 und 12 um liegen. Dickere Querschnitte können mit den PEN-Membran Folien erfasst werden.
LCM bietet eine technische Kapazität, sehr genaue Sezieren von Gewebe und Zellen, die aus Objektträgern zu machen. Dies erhöht die Auflösung der weiteren Analyse im Vergleich zu Brutto-Dissektion der Gewebestücke. Obwohl, LCM können zeit- und arbeitsintensiv sein, ist es nicht eine umfassende Ausbildung und Know-how und erfordern, wenn sie mit anderen Hochdurchsatztechnologien, stark das Verständnis eines biologischen Prozesses zu verbessern, wenn einzelne Zellen oder anatomischen Regionen eingesetzt werden.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the National Institute of Mental Health (1R15MH084209 – 01A1), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R21NS058375-01A2) and the National Science Foundation (DBI0723080 07070646).
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Numer | Comments |
Veritas Laser Capture Microdissection System | Life Technologies, Grand Island, NY | Newer model is now sold | |
CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies, Grand Island, NY | LCM0211 | |
CapSure HS LCM Caps | Life Technologies, Grand Island, NY | LCM0213 | |
PEN Membrane slides | Life Technologies, Grand Island, NY | s4651 | |
Silane prep-slides | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S4651 | |
95% Ethanol-RNase Free | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7148 | |
100% Ethanol-RNase Free | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
Rnase Free Triton | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8787 | |
Molecular Sieve | EDM Millipore, Billerica, MA | MX1583D | |
Anti-Tyrosine hydroxyase antibody | EDM Millipore, Billerica, MA | Ab152 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies, Grand Island, NY | A-11008 | |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2939AA | |
Stratagene MX 3005P | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 401513 | |
Nanodrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ||
Quant-iT RiboGreen | Life Technologies, Grand Island, NY | R11490 | |
RNaseZap | Life Technologies, Grand Island, NY | AM9780 |