Summary

말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

Published: January 28, 2015
doi:

Summary

직접 방법 말초 혈 세포로부터 농축 조혈 전구 세포로부터 인간 신경 줄기 세포를 유도하기 위해 개발되었다.

Abstract

인간의 질병 특정의 연결을 문화는 인간의 신경 질환에 대한 체외 모델의 생성에 필수적이다. 그러나, 인간 성인 일차 배양 신경에 대한 액세스는 고유의 부족 문제를 제기한다. 유도 만능 줄기 세포의 최근 개발 (IPSC)는 환자의 특정 IPSC을 통해 피부 섬유 아 세포에서 신경 문화를 유도하기 위해 또 다른 방법을 제공하지만,이 과정은 노동 집약적이며, 특별한 전문 지식과 자원의 많은 양을 필요로하고, 몇 달이 걸릴 수 있습니다. 이것은 신경 질환의 연구에이 기술의 다양한 응용 프로그램을 방지 할 수 있습니다. 이러한 문제들을 극복하기 위해, 우리는 IPSC 도출 과정을 거치지 않고, 직접 사람 성인 말초 혈액으로부터 신경 줄기 세포를 유도하는 방법을 개발 하였다. 성인 인간의 말초 혈액에서 농축 조혈 전구 세포가 시험 관내에서 배양하고 10 월을 전사 요인 SOX2 함유 센다이 바이러스 벡터로 형질3/4, Klf4 및 c-Myc와. 상기 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)와 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 포함하는 인간 신경 전구 매체를 이용하여 선택되는 세포의 형태 학적 변화의 형질 전환 결과. 생성 된 세포는 네 스틴과 같은 SOX2 같은 신경 줄기 세포 마커에 대한 발현을 특징으로한다. 이러한 신경 줄기 세포는 더 뉴런, 아스트로 글 리아 세포가 지정된 차별화 미디어에서 희소 돌기 아교 세포로 분화 될 수있다. 쉽게 접근 인간 말초 혈액 샘플을 사용하여,이 방법은 신경 질환의 체외 모델링 신경 세포로 더욱 분화 신경 줄기 세포를 유도하는데 이용 될 수 있으며, 이들 질환의 병인 및 치료에 관한 시험을 진행할 수있다.

Introduction

시험관 내에서의 연결을 문화는 신경 질환의 연구를위한 기본적인 도구로 사용되어왔다. 일차 동물 (주로 쥐) 신경 배양 1, 2, 또는 다른 신경 교종 종양에서 유래 인간 신경 세포주는 가장 일반적으로 사용되는 등의 연구에있다. 그러나, 설치류 및 인간 세포 사이에 상당한 차이가 있음을 인식하고있다. 설치류에 기초하여 다수의 발견은 인간으로 변환 될 수 없다. 또한, 대량의 게놈 정보 및 비교적 쉽게 유전자 편집 및 총 유전체 분석의 급속한 발전과 함께, 추세는 더욱 기어 몇몇 인간 신경 세포를 만드는 질병 경향 유전자를 검색하고 특정 질환의 기능 및 역할을 서술하는 것 세포주 만 사용을 제한. 이론적으로, 환자 신경계의 샘플에서 파생 된 인간의 기본 신경 문화 최선의 선택을하지만 그들은 얻을 불가능하다; 따라서 다른 메타ODS가 필요합니다. 최근 몇 년 동안, 몇몇 접근법은 두 가장 구별되는 함께 진행되고있다. 생성 유도 된 다 능성 줄기 세포 (IPSC)을 사용하여 마우스 및 인간 체세포 기술의 발달에 따라 3, 4는, 신경 세포들을 상기 5-7에서 차이가있을 수있다. 그러나, 생성 및 IPSC을 특성화하는 것은 노동 집약적, 기술, 시간 입력을 요구하고, 때로는 엄청나게. 얼마 후, 또 다른 접근 방식은 직접 체세포 8, 9에서 신경 세포를 변환하기 위해 개발되었다. 생성 된 뉴런 비 증식하는, 그 예의 연구 및 세포 많이 필요 약물 스크리닝에의 응용을 제한한다. 두 가지 기술, 신경 줄기를 직접 유도의 장점을 활용하려면 / 체세포에서 전구 세포는 여전히 IPSC 생성 및 특성화하지만 있습니다 provi의 지루한 과정을 거치지 여러 그룹 10-12에 의해 탐구되었다데 나중에 신경 분화 신경 줄기 세포의 괜찮은 번호. 우리는 이전에 조혈 전구 세포로 야마나카 전사 인자의 도입 다음, 신경 줄기 세포가 직접적으로 매체 (13)를 선택하는 신경 전구 세포를 이용하여 생성 될 수 있음을 보여 주었다. 여기서 우리는 자세히 방법을보고한다.

Protocol

성인 전혈 1. 농축 조혈 전구 세포 주 : 조혈 전구 세포 또는 CD34 + 세포를 밀도 구배 원심 분리 기반의 방법을 이용하여 제대혈, 백혈구 성분 채집 물질 및 전혈을 다양한 소스로부터 유도 된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 정제 될 수있다. 여기에 나열된 방법은 예를 들어 전혈을 사용한다. 전체 혈액에서 PBMC를의 분리 : 삽입물의 중앙 구멍을 피펫 팅하여 SepMa…

Representative Results

CD34 세포의 품질은 신경 줄기 세포 전달의 성공에 중요하다. 높은 품질의 CD34 세포는 문화의 일의 처음 몇 동안 증식 단지 배양 용기 (그림 1A)의 바닥 위에 떠, 비 점착성, 균일 라운드 세포로 나타납니다. 세포의 확장이 아닌 특정 세포 집계 세포 배양 중에 발생할 수 있지만, 시간 (그림 1B)를 통해 확장 집계 및 협회의 성공적인 감염 결과가 느슨하다. 부착 세포는 일?…

Discussion

직접 주연 조혈 전구 세포로부터 신경 줄기 세포를 생성하는 상세한 프로토콜이 제공된다.

섬유 아세포에 비교하여, 인간 말초 혈액 더 접근 할 수있다. 제시된 프로토콜 이상 1 × 105 조혈 전구 세포 또는 CD34 양성 세포를 이용하여, 전혈을 10 ㎖에서 농축 될 수있다. 혈소판 오염 보통 예방하지 않지만, 용이하게, 저속 원심 분리에 의해 감소​​ 될 수 있으며 신경 줄?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Materials

Material List
Name Company Catalog Number Comments
Lymphocyte Separation Medium Lonza 17-829E 1 X
SepMate Stemcell Technologies 15415 15 mL
Human Serum Invitrogen 34005-100
Antibiotics Gibco 15240-062 1%
CD34 MultiSort Kit Miltenyi Biotec 130-056-701
EDTA Cellgro 46-034-Cl  2mM
MACS LS Column Miltenyi Biotec 130-042-401
StemSpan SFEM Medium Stemcell Technologies 9650 1X
IMDM Quality Biologicals 112-035-101 1X
TPO Peprotech 300-18 100 ng/mL
Flt-3 Peprotech 300-19 100 ng/mL
SCF Peprotech 300-07 100 ng/mL
IL-6 Peprotech 200-06 20 ng/mL
IL-7  Peprotech 200-07 20 ng/mL
IPS Sendai Reprogramming Kit Life technologies A1378001
Cell scraper Sarstedt 83.183
DMSO Sigma D2650
CryoTube vials Thermo 368632
Mr. Frosty container Thermo 5100-0001
DMEM/F12 Life technologies 12400-024 1X
N2 supplement Life technologies 17502-048 1X
Bovine serum albumin Sigma A2934 0.1% (w/v)
bFGF Peprotech 100-18B 20 ng/ml
EGF Peprotech AF-100-15
B27 supplement Life technologies 17504-044 1X
NSC serum free medium Life Technologies A1050901 1X
Poly-D-lysine/laminin coated cover slips BD Bioscences 354087
cAMP Sigma A9501 300 ng/ml
Vitamin C Sigma A0278 0.2 mM
BDNF Peprotech 450-02 10 ng/ml
GDNF Peprotech 450-10 10 ng/ml
Poly-L-Ornithine Sigma P4957 1X
PDGF-AA Peprotech 100-13A 10 ng/ml
NT-3 Peprotech 450-03 2 ng/ml
Shh Peprotech 1314-SH/CF 2 ng/ml
T3 Sigma T6397 3 nM
PFA Sigma P6148 4%
PBS Quality Biological 119-069-101 1X
Goat serum Sigma G9023 4%
TritonX-100 Sigma T9284
Mouse monoclonal anti-Nestin Millipore AB5922 1:1000 dilution
Anti-SOX2  antibody Applied Stemcell ASA0120 Ready to use
Mouse anti-βIII-tubulin antibody Promega G712A 1:1000 dilution
Rabbit anti-GFAP antibody Sigma G4546 1:100 dilution
Anti-O4 antibody R&D Systems MAB1326 IgM; 1 ng/ml
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody Life techniologies A11012 1:400 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody Life techniologies A11001 1:400 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody Life techniologies A21042 1:250 dilution
DAPI Sigma D9542 1 ug/ml

Referenzen

  1. Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941 (2011).
  2. Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  5. Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. Characterization of Human Huntington’s Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells. PLoSCurr. 2, RRN1193 (2010).
  6. Park, I. H., et al. Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  7. Song, B., et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis. Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).
  8. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  9. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).
  10. Lee, S. -. T., et al. Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts. PLoS ONE. 6, e21801 (2011).
  11. Thier, M., et al. Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  12. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).
  13. Wang, T., et al. Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation. PLoS ONE. 8, e81720 (2013).
  14. Jin, C. H., et al. Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells. Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).
  15. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).
  16. Goolsby, J., et al. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).

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Diesen Artikel zitieren
Wang, T., Choi, E., Monaco, M. C. G., Major, E. O., Medynets, M., Nath, A. Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (95), e52298, doi:10.3791/52298 (2015).

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