Medición de la estabilidad de proteínas en la sala de embriones de pez cebra Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP)
Summary
Los niveles de proteína en células y tejidos son a menudo estrechamente regulada por el equilibrio de la producción y eliminación de proteínas. Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP), la cinética de eliminación de proteínas pueden ser medidos experimentalmente in vivo.
Abstract
Estabilidad de la proteína influye en muchos aspectos de la biología, y la medición de la cinética de eliminación de proteínas puede proporcionar importantes conocimientos sobre los sistemas biológicos. En experimentos FDAP, la liquidación de las proteínas dentro de los organismos vivos se puede medir. Una proteína de interés se marca con una proteína fluorescente fotoconvertible, expresada in vivo y photoconverted, y la disminución en la señal de photoconverted lo largo del tiempo se controla. Los datos se ajusta entonces con un modelo de espacio libre apropiado para determinar la vida media de la proteína. Es importante destacar que la cinética de remoción de las poblaciones de proteínas en los diferentes compartimentos del organismo pueden ser examinados por separado mediante la aplicación de máscaras compartimentales. Este enfoque ha sido utilizado para determinar la vida media intra y extracelulares de las proteínas de señalización secretadas durante el desarrollo de pez cebra. Aquí se describe un protocolo para experimentos FDAP en embriones de pez cebra. Debería ser posible utilizar FDAP para determinar la cinética de remoción decualquier proteína taggable en cualquier organismo ópticamente accesible.
Introduction
Los niveles de proteínas en células y organismos están determinadas por sus tasas de producción y el aclaramiento. Proteínas vidas medias pueden variar desde minutos a días 1-4. En muchos sistemas biológicos, la estabilización o eliminación de proteínas clave tiene efectos importantes sobre la actividad celular. Se requiere la modulación de la estabilidad de la proteína intracelular para la progresión del ciclo celular 5,6, la señalización del desarrollo 7-9, apoptosis 10, y la función normal y el mantenimiento de las neuronas 11,12. Estabilidad de la proteína extracelular afecta a la distribución y la disponibilidad de las proteínas secretadas, tales como morfógenos 13,14, dentro de un tejido.
Durante las últimas décadas, la estabilidad de proteínas principalmente se ha evaluado en cultivo celular utilizando pulsos marcaje radioactivo o experimentos de persecución cicloheximida 15. En estos experimentos de pulso-caza, las células son o bien transitoriamente expuestos a un "pulso" de amino radiactivoprecursores de ácido que se incorporan en las proteínas recién sintetizadas, o que están expuestos a la cicloheximida, que inhibe la síntesis de proteínas. Las células cultivadas se recogen a diferentes puntos de tiempo, y, o bien inmunoprecipitación seguido por autorradiografía (en los experimentos de pulso-caza radiactivos) o Western Blot (en experimentos de cicloheximida) se utiliza para cuantificar la liquidación de la proteína en el tiempo.
Ensayos de estabilidad de proteínas convencionales tienen varias deficiencias. En primer lugar, las proteínas en estos ensayos a menudo no se expresan en sus entornos endógenos, sino más bien en el cultivo de tejidos y algunas veces en las células de diferentes especies. Para las proteínas cuya estabilidad es dependiente del contexto, este enfoque es problemático. En segundo lugar, no es posible seguir el aclaramiento de proteínas en las células individuales o los organismos con el tiempo, y los datos de estos ensayos refleja un promedio de diferentes poblaciones de células en diferentes puntos de tiempo. Dado que las células individuales pueden haber comenzadocon diferentes cantidades de proteína, pudo haber tomado la etiqueta o cicloheximida radiactivo en diferentes momentos, o puede tener diferentes cinética de depuración, tales datos agregados podrían ser engañosas. Finalmente, en el caso de los experimentos de persecución cicloheximida, la adición del inhibidor de la síntesis de proteínas puede tener efectos fisiológicos no deseados que podrían alterar artificialmente estabilidad de la proteína 16-18. Estas deficiencias se pueden evitar mediante el uso de fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP), una técnica que utiliza proteínas fotoconvertible para medir la eliminación de proteínas de forma dinámica en los organismos vivos 19-25 (véase la discusión de las limitaciones de la técnica FDAP).
Proteínas fotoconvertible son proteínas fluorescentes cuya excitación y de emisión propiedades cambiar después de la exposición a determinadas longitudes de onda de la luz 26. Una variante comúnmente usado es Dendra2, una proteína fotoconvertible "-verde a rojo" que tiene inicialmente excitas y emisión propiedades similares a las proteínas fluorescentes verdes, pero después de la exposición a "fotoconversión" UV iluminación -su de excitación / propiedades de emisión se vuelven similares a los de las proteínas fluorescentes rojas 23,27. Es importante destacar que, nueva proteína producida después de fotoconversión no tendrá las mismas propiedades de excitación / emisión como la proteína photoconverted, lo que permite el desacoplamiento de la producción y el despacho al fotoconversión y la observación de sólo una piscina de la proteína photoconverted. Etiquetado de proteínas de interés con proteínas fotoconvertible tanto, proporciona una manera conveniente a pulso la etiqueta proteínas en organismos vivos, ópticamente accesibles intactas.
En los ensayos de FDAP (Figura 1A), una proteína de interés se marca con una proteína fotoconvertible y se expresa en un organismo vivo (Figura 1B). La proteína de fusión se photoconverted, y la disminución en la señal photoconverted lo largo del tiempo se controla mediante fluorescenmicroscopía ce (Figura 1C). Los datos se ajusta entonces con un modelo apropiado para determinar la vida media de la proteína de fusión (Figura 1D).
El ensayo FDAP descrito aquí fue diseñado para determinar las vidas medias extracelulares de las proteínas de señalización secretadas en embriones de pez cebra durante la embriogénesis temprana 19. Sin embargo, este enfoque puede ser adaptado a cualquier organismo modelo transparente que tolera la formación de imágenes en vivo, y podría ser utilizado para monitorear la liquidación de cualquier proteína intracelular o extracelular taggable. Las variaciones de la técnica descrita aquí se han realizado en células cultivadas Drosophila 20,23 y 22 y 21 embriones de ratón.
Protocol
Representative Results
Discussion
El éxito de un experimento FDAP se basa en la generación de una proteína de fusión fotoconvertible funcional. Etiquetado de una proteína puede afectar a su actividad biológica y / o propiedades biofísicas, incluyendo su localización, la solubilidad y la estabilidad 36-41. Estar preparado para probar la actividad de varias construcciones de fusión diferentes con el fin de encontrar uno que es activo. Hemos encontrado que el cambio de la posición de la proteína fotoconvertible relación a la proteín…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Jeffrey Farrell, James Gagnon, y Jennifer Bergmann para comentarios sobre el manuscrito. KWR fue apoyada por el Programa de Becas de la Fundación Nacional de Ciencia de Posgrado de Investigación durante el desarrollo del ensayo FDAP. Este trabajo fue apoyado por becas de los NIH para AFS y por becas de la Fundación Alemana de Investigación (Programa de Emmy Noether), la Sociedad Max Planck, y el Programa de Human Frontier Science (Premio de carrera) a PM.
Materials
| PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) | Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems. | ||
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340) | To generate capped mRNA for injection into embryos | ||
| Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682) | Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks | ||
| 6-well plastic dish (BD Falcon) | Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting | ||
| Embryo medium | 250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147) | Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage | ||
| 5 cm diameter glass petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 200 ml glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage | ||
| Stereomicroscope | For injecting and mounting embryos | ||
| 1x Danieau's medium | Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2 | ||
| UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100) | For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40 – 42 °C when ready to use | ||
| Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT) | For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos | ||
| Metal probe | For positioning embryos during mounting | ||
| Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C) | Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5 | ||
| 15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium | For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette | ||
| Inverted laser scanning confocal microscope | A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required | ||
| Heated stage | To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment | ||
| Confocal software capable of time-lapse imaging | Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals | ||
| 25x or 40x water objective | Objective for imaging | ||
| 10x air objective | Objective for photoconversion | ||
| Immersion oil | Immersion oil with the same refractive index as water |
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