测量生活中的斑马鱼胚胎蛋白质稳定性使用荧光衰减光转化后（FDAP）

蛋白质在细胞和生物体的水平由生产和清除它们的速率来确定。蛋白质的半衰期的范围可以从几分钟到几天^1-4。在许多生物系统，关键蛋白的稳定或间隙对细胞活性有重要影响。所需的细胞周期进展^5,6，发育信号^7-9，细胞凋亡^10，和正常功能和维持神经元^11,12的细胞内蛋白质稳定性调制。胞外蛋白的稳定性影响的分布和分泌的蛋白质，如形态发生^13,14的可用性，组织内。

在过去的几十年中，蛋白质稳定性已经主要在细胞培养用放射性脉冲标记或放线菌酮追踪实验¹⁵评估。在这样的脉冲追踪实验，将细胞或者瞬时暴露于一个“脉冲”放射性氨基的酸前体掺入到新合成的蛋白质，或它们暴露于放线菌酮，抑制蛋白质的合成。培养的细胞，然后在不同时间点收集，并且任一免疫沉淀，随后进行放射自显影（放射性脉冲追踪实验）或免疫印迹（在放线菌酮的实验）被用来量化蛋白质的间隙随时间。

常规的蛋白质稳定性试验有几个不足之处。首先，在这些测定蛋白质通常不表达在其内源性的环境中，而是在组织培养，有时在来自不同物种的细胞。对于蛋白质的稳定性是依赖于上下文的，这种方法是有问题的。其次，它是不可能跟随蛋白清除在个体细胞或生物体随着时间的推移，而从这些分析中的数据反映了在不同时间点的平均细胞的不同种群。由于单个细胞可能已经开始用不同量的蛋白质，也可能采取了放射性标记或酮在不同的时间，或可具有不同的间隙动力学，例如聚合数据可能是误导性的。最后，在放线菌酮的追踪实验的情况下，另外的蛋白质合成抑制剂的可能产生意想不到的生理效果，可以人为地改变蛋白质稳定性^16-18。这些缺点，可避免使用荧光衰减后光转化（FDAP），其利用photoconvertible蛋白质来动态测量在活生物体^19-25蛋白清除的技术（见讨论用于FDAP技术的限制）。

Photoconvertible蛋白的荧光蛋白的激发和发射特性暴露于光²⁶特定波长后更改。一种常用的变体是Dendra2，“绿色到红色”photoconvertible蛋白最初具有前引文和发射性质类似于绿色荧光蛋白，但暴露于UV轻“光转化”后-其激发/发射性能变得类似于红色荧光蛋白^23,27。重要的是，光转化后产生的新的蛋白质将不会有相同的激发/发射性质的光转换蛋白，允许生产和清除的经光转化解耦光转换蛋白质的仅一个池和观察。标记与photoconvertible蛋白兴趣蛋白质从而提供了一个方便的方法来进行脉冲标记蛋白在完整的，光学访问的活生物体。

在FDAP测定（ 图1A）中，感兴趣的蛋白被标记为一个photoconvertible蛋白和表达在生物体（ 图1B）。该融合蛋白是光转换，并降低在光转换信号随着时间的推移由fluorescen监视CE显微镜（ 图1C）。然后，数据被装有合适的模型，以确定融合蛋白（ 图1D）的半衰期。

此处所描述的测定法FDAP被设计在早期胚胎发育¹⁹来确定外半衰期在斑马鱼胚胎分泌信号蛋白。但是，这种方法可以适用于任何透明模型生物体容忍实时成像，并且可以被用于监控任何taggable胞内或胞外蛋白的清除。此处所描述的技术的变型中培养的细胞^20,23和²² 果蝇和小鼠胚胎²¹已被执行。