This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.
Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP).
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed.
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates.
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.
Et stort problem med at gennemføre nyttige terapier til behandling af sygdomme i nervesystemet er i at udvikle effektive metoder, der forhindrer yderligere degeneration og også letter genvinding af funktion. En innovativ strategi er at genetisk manipulation stamceller ex vivo, til produktion af neurobeskyttende faktorer, inden deres transplantation. Denne kombination af celle-baseret behandling, kombineret med en type genterapi tilvejebringer en effektiv metode til behandling af sygdom eller skade-inducerede neuronal død i nervesystemet.
Neurotrofiske faktorer er afgørende for væksten og overlevelsen af udviklende neuroner samt vedligeholdelse og plasticitet af modne neuroner. En række undersøgelser har vist betydelige roller neurotrofiske faktorer i at fremme indledende vækst og differentiering af neuroner i det centrale og perifere nervesystem (CNS og PNS), og de kan også stimulere regenerering in vitro og i enNimal modeller af neural skade 1. Hjerne-afledt neurotrofisk faktor (BDNF) er højt udtrykt i CNS og spiller vigtige roller i reguleringen af neural udvikling, synaptisk plasticitet og reparation 2. Gliacellelinie-afledt neurotrofisk faktor (GDNF) fremmer overlevelsen af mange typer af neuroner, herunder dopaminerge og motorneurons 3. Således en vigtig strategi for neural reparation er at tilvejebringe exogene kilder neurotrofiske faktorer til den tilskadekomne eller syge områder af nervesystemet.
Multipotente knoglemarv-afledte mesenchymal-stamceller (MSC'er) har stort potentiale for afgivelse af terapeutiske proteiner til behandling af den beskadigede eller syge nervesystem. Transplantation af MSC'er har tiltrukket sig betydelig opmærksomhed i bestræbelserne på at udvikle patientens kompatible cellebaserede behandlingsformer, da de har en række fordele, herunder, 1) relativt lette isolation og vedligeholdelse, 2) multipotentielle kapacitet, 3) små etiske betænkeligheder, 4) Evne til at overleve og migrere efter transplantation og 5) muligheder for autolog transplantation 4,5. Lovende resultater er blevet rapporteret ved anvendelse af naive og genetisk manipulerede MSC'er i dyremodeller for en række forskellige neurodegenerative tilstande, herunder rygmarvsskade 6,7, slagtilfælde 8,9, myelin mangel 10 og retinal degeneration 11-13. Kobling celletransplantation med levering af neurotrofiske faktorer fra genetisk manipulerede stamceller er en hidtil ukendt og vigtig neural reparation strategi.
Et væsentligt skridt i udviklingen af cellebaserede terapeutisk faktor doseringssystemer er at fastsætte den normale sundhedstilstand manipulerede celler. Som sådan er hovedformålet med denne undersøgelse var at evaluere de generelle vækst parametre gensplejsede voksne stamceller. En vigtig metode til hurtigt at vurdere flere celleparametre er at ansætte cellulær billede-baserede high-through screening (HTS), der ofte omtales som højt indhold screening (HCS) procedurer 14. Denne teknologi gør det muligt for indsamling og analyse af automatiseret billede og denne fremgangsmåde er særlig velegnet til stamcelleforskning applikationer. I dette projekt udviklede vi en profilering platform, der giver mulighed for hurtig karakterisering og optimering af celle substrat præferencer og cellulære funktioner med gensplejsede voksne stamceller ansætte en HCS-system.
Voksne mesenkymale stamceller (MSC'er) er et attraktivt celletype til udvikling af en eksperimentel strategi, der kombinerer et cellulært og genafgivelse baseret terapi. MSC'er er multipotente i stand til at differentiere til celler af mesodermal afstamning, og vise betydelig plasticitet, differentiere / transdifferentiating i neuronale og gliale afstamninger med passende induktion paradigmer 17,18. Endvidere har MSC'er blevet transplanteret og i prækliniske undersøgelser vist sig effektiv for en række lidelser, herunder neurodegenerative tilstande 19. Den terapeutiske effekt af MSC'er er velkendt på grund af deres gavnlige anti-proliferative, anti-inflammatoriske og anti-apoptotiske aktiviteter 20. MSC'er er også kendt for at producere og udskille forskellige neurotrofiske og vækstfaktorer, som sandsynligvis bidrager til de neurobeskyttende egenskaber, der er forbundet med naive MSC'er efter transplantation på steder med skade eller sygdom 21. Importantly kan MSC'er genetisk modificeret med henblik på vedvarende levering af neurotrofiske faktorer for kombinerede cellulær og gen-terapi-baserede applikationer og er blevet anvendt i en række dyremodeller for skade eller sygdom til CNS 11,19,22.
Ved at udvikle en kombineret cellulært og genterapi funderet, er det vigtigt, at sundheden af cellerne omhyggeligt vurderes forud for deres omfattende brug for in vitro, og især in vivo applikationer. Som et bevis for koncept, vi undersøgte flere populationer af konstruerede og kontrol MSC linjer for at studere konsekvenserne af de genetiske ændringer på celle sundhed og fitness hjælp af et højt indhold screening (HCS) tilgang. Generelt HCS henviser til cellulær billedbaseret high throughput screening 14. Denne screening tilgang tillader en kvantitativ vurdering af cellulære fænotyper på flere niveauer af fysisk (celle til subcellulær) og tidsmæssige (millisekunder til dage) resolution tværs af forskellige eksperimentelle betingelser. Ved hjælp af denne metode, vi adgang til eventuelle forskelle i substrat præference på følgende parametre: celleproliferation, udtryk for grønt fluorescerende protein (GFP), celledød og cellemotilitet / migration. Eksperimenter blev designet i 96-brønds celledyrkningsplade format. Inden for en enkelt plade vi rutinemæssigt undersøgt mulige substrat-relaterede forskelle med hensyn til hver parameter for de forskellige MSC populationer af lentivirale-transducerede celler og sammenlignet de manipulerede MSC'er med det oprindelige, ikke-transducerede MSC. Dette gav et middel til direkte at sammenligne resultaterne for de forskellige MSC undertyper med et batteri af in vitro-assays, såsom celleproliferation ved hjælp Ki67 immunolabeling, live / døde cellernes levedygtighed under anvendelse propidiumiodidfarvning, og celle adfærd ved at udføre time-lapse digitale billeder . I forlængelse af denne HCS kan man også udføre ELISA'er på konditionerede medier prøver fra individuel walen for kvantitativt at bestemme udskillelsen af neurotrofiske faktorer. Konditioneret medie fra forskellige MSC-undertyper kan også anvendes i in vitro-bioassays for at bestemme den biologiske aktivitet af udskilte faktorer 11,23. Denne type HCS platform kan også anvendes til in vitro målinger af neuritudvækst fra primære neuronale kulturer og neurale stamcellelinjer 24. Samlet set vores resultater viste, at delpopulationerne af de genetisk modificerede MSC'er viste lignende adfærd i forhold til de ikke-modificerede MSC'er. Indflydelsen af forskelligartede kultur substrater på cellevækst og cellevandring ikke var dramatisk anderledes mellem MSC undertyper, samt kultur substrater. Som sådan har den ekstracellulære matrix testede substrater ikke synes at spille en kritisk rolle ved modulering af disse aspekter af celle adfærd for disse forskellige Engineered MSC'er.
Denne undersøgelse viser anvendelsen af et HCS-system til analyse different aspekter af celle adfærd. Imidlertid er det ikke ualmindeligt at støde begrænsninger forbundet med billedanalyse. Den lejlighed, mens analysere fluorescensbilleder, det var lidt svært at bestemme den korrekte grænseværdi over hvilken immunolabeled eller farvede celler vil blive talt som positivt mærket / plettet. Således at minimere subjektive bias, fastsættelsen af tærskelværdier var afhængig af en sammenligning med kontroller (negative kontroller for fluorescens billeddannelse blev udført parallelt under al behandling ved udeladelsen af de primære eller sekundære antistoffer). En anden begrænsning opstod under analysen af cellemigrering hjælp tids- bortfalder digital billedbehandling. I nogle tilfælde imaging software ikke var i stand til at skelne mellem tilfældige Brownske bevægelser af en celle versus en celle faktisk migrere kun en meget kort afstand. Yderligere begrænsninger var tydelige i situationer, hvor analyse software ikke var i stand til at skelne tilstedeværelsen af multiple celler i meget tæt nærhed til en anden. For at overvinde denne begrænsning krævede udvælgelse manuel celle under analysen snarere end en fuldt automatiseret analyse. Cell udpladningsdensitet kan også resultere i skævvridning datacelle vandring mellem populationer af celler, der udviser større præference at vokse i klumper versus celler, der vokser i isolation fra hinanden. Disse typer af forskelle i del sandsynligt en refleksion af celle-substrat versus celle-celle præferencer.
Brug af et HCS-system til at erhverve billeder og udfører dataanalyse giver en effektiv og hurtig måde til at vurdere flere celleparametre. Desuden blev time-lapse digitale videoer i 30 forskellige betingelser (6 substrater og 5 forskellige MSC undertyper) rutinemæssigt erhvervet i en periode fra timer til dage (48 timer), mens du bruger den miljømæssige kammer. Disse data blev efterfølgende anvendt til at beregne og bestemme forskelle i celle migration satser på tværs af forskellige cellelinjer på forskellige ECMmolekyler.
I denne rapport har vi sat fokus på gennemførelsen af et højt indhold screening platform til at vurdere celle sundhed og funktion. Denne type analyse er nyttigt for at udvikle rationelle strategier til at designe celletyper samt polymersubstrater at lette rettet cellevækst og neural regeneration. Dette er et vigtigt skridt hen imod anvendelsen af stamceller-baserede levering af terapeutiske faktorer forud for omfattende in vivo prækliniske undersøgelser under anvendelse af celle transplantation strategier.
The authors have nothing to disclose.
Funding for this research was provided by the US Army Medical Research and Materiel Command (Grant account no. W81XWH-11-1-0700) and the Stem Cell Research Fund. PAB and EMP were recipients of Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).
96 well plates | Greiner Bio One | 655090 | 96 well plates selected for use in ImageXpress |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | A9647 | |
Rabbit anti-Ki67 antibody | Abcam (Cambridge, MA) | Ab16667 | 1:200 dilution |
Collagen type I | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | C7661 | Collagen from rat tail |
DAPI | Invitrogen (Carlsbad, CA) | D3571 | |
Donkey anti-Rabbit Cy3 | Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) | 711-165-152 | 1:500 dilution |
ECL(Entactin-Collagen-Laminin) | Millipore/Chemicon (Temecula, CA) | 08-110 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Logan, UT) | SH30071.03 | |
Equine serum | Hyclone (Logan, UT) | SH3007403 | |
Ethanol | Chemistry Store (Ames, IA) | 12003510 | 100%, 200 proof |
Fibronectin | Fisher Scientific (Hampton, NH) | CB-40008 | |
Iscove’s Modified Dulbeccos Medium (IMDM) | Hyclone (Logan, UT) | SH30396.03 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific (Hampton, NH) | P285 | For PO4 buffer |
K2HPO4 | Fisher Scientific (Hampton, NH) | P288 | For PO4 buffer |
L-Glutamine | Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY) | 25030-081 | |
Laminine (mouse) | Trevigen (Gaithersburg, MD) | 3400-010-01 | |
Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice | Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA) | Isolated from bone marrow | |
Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF) | These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation) | ||
Normal donkey serum (NDS) | Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) | 017-000-121 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific (Hampton, NH) | O4042 | 4% PFA in 0.1M PO4 buffer |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P0781 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P4417 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P4707 | |
Propidium iodide (PI) | Invitrogen (Carlsbad, CA) | P1304MP | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | X100 | |
Trypsin 0.05% (EDTA 1X) | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 25300-054 | |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 12440–046 | |
Hybridoma-qualified FBS | Hyclone (Logan, UT) | SH30396.03 | |
Equine serum | Hyclone (Logan, UT) | SH3007403 | |
ImageXpress Micro | Molecular devices (Sunnyvale, CA) | ImageXpress micro | High content screening system |
MetaXpress 4.0 | Molecular devices (Sunnyvale, CA) | MetaXpress 4.0 | Image acquisition and analysis software |