Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.
Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में बीमारी या चोट के भड़काऊ प्रतिक्रिया खराब विशेष रूप से ऊतक के भीतर प्रतिरक्षा और निवासी कोशिकाओं के बीच बातचीत का संबंध है, समझा जाता है। रीढ़ की हड्डी में इन सेलुलर बातचीत की जांच रहने वाले जानवर में विशेष रुचि के हैं। केवल आसानी से सुलभ सीएनएस सफेद पदार्थ पथ यह संभव प्रयोगात्मक दृष्टिकोण में सुधार के प्रयासों पर ध्यान केंद्रित करने की है जिस पर एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है, जिससे रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय स्तंभों में है। इन जांच की वजह से पहुँचने और इमेजिंग के लिए सीएनएस स्थिर में तकनीकी कठिनाई को सीमित कर दिया गया है। रीढ़ की हड्डी में लाइव इमेजिंग प्रारंभिक अपमान के बाद कुछ ही घंटों के परे एक रीढ़ की हड्डी में चोट में इससे पहले, हालांकि, कुछ अध्ययनों 1-13 संबोधित किया सेलुलर आंदोलन वर्णित किया गया है। दर्दनाक रीढ़ की हड्डी घाव न्यूरॉन्स, astrocytes, fibroblasts, NG2 पूर्वज कोशिकाओं, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं includi के साथ एक जटिल माहौल हैmicroglia, न्यूट्रोफिल, मैक्रोफेज, टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं और वृक्ष के समान कोशिकाओं 14,15 एनजी। मैक्रोफेज प्रचलन से घुसपैठ घाव में phagocytosis के लिए जिम्मेदार प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सबसेट हैं। इन phagocytic कोशिकाओं की भूमिका इन कोशिकाओं घायल ऊतकों में हानिकारक और सुरक्षात्मक भूमिकाओं दोनों पर ले जा सकते हैं यह दर्शाता है कि रिपोर्ट के साथ, बहस की गई है। इन भूमिकाओं घायल जानवर 21,23,24 में कार्यात्मक घाटा एक घाव पर लेने phenotype के उपचार और कम करने के लिए, एक चोट के बाद माध्यमिक axonal dieback बढ़ रही है और एक phagocytic ढंग 16-22 में अभिनय से लेकर।
इससे पहले, मुख्य रूप से स्वस्थ ऊतकों में आकृति विज्ञान पर भरोसा किया है microglia से मैक्रोफेज भेद करने के लिए प्रयास करता है। हालांकि, सक्रिय microglia और मैक्रोफेज एक ही मार्करों के कई एक्सप्रेस और बस का अध्ययन करने के लिए मुश्किल इन कोशिकाओं की विभिन्न गतिविधियों की जुदाई, जिससे चोट 25-29 के बाद पृथक आकृति विज्ञान प्रदर्शित30 अकेले इन कारकों पर एड। इस दृष्टिकोण vivo में इन प्रकार की कोशिकाओं के भेदभाव में कम उपयोगी है, हालांकि इन कोशिकाओं, 33,34 प्रवाह cytometry का उपयोग CD45 के अंतर अभिव्यक्ति के द्वारा अलग किया जा सकता है। Monocytes के रूप में इन मार्करों की अभिव्यक्ति में गतिशील परिवर्तन सटीक विश्लेषण 35,36 जटिल हो सकता है मैक्रोफेज में अंतर हालांकि microglia और मैक्रोफेज में CCR2 और CX3CR1 का उपयोग अंतर अभिव्यक्ति भी पता लगाया गया है। मैक्रोफेज अस्थि मज्जा पूर्वज से ली गई है और एक अपमान 31,32 के बाद घायल सीएनएस में प्रवेश कर रहे हैं, जबकि microglia, सीएनएस में निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं रहे हैं और भ्रूण के विकास के दौरान जर्दी थैली पूर्वज से उत्पन्न होती हैं। इन दो प्रकार की कोशिकाओं भेद करने के लिए आकृति विज्ञान का उपयोग करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण सीएनएस निवासी संरक्षण, जबकि दाता पूर्वज से व्युत्पन्न मैक्रोफेज में एक मिल मार्कर व्यक्त एक दाता जानवर से पूर्वज के साथ अस्थि मज्जा की जगह है, recipient व्युत्पन्न microglia। ये अस्थि मज्जा चिमेरिक मॉडल आमतौर पर कई अन्य अनुप्रयोगों 37-40 में उपयोग किया जाता है। इस विधि जिससे कुछ अनुप्रयोगों में इसके उपयोग को सीमित करने, मेजबान में मज्जा पूर्वज उन्मूलन करने के लिए इस्तेमाल विकिरण या साइटोटोक्सिक दवाओं की वजह से रक्त मस्तिष्क बाधा की अखंडता को क्षति के साथ जुड़े अद्वितीय निरंतर है। हाल ही में, सीएनएस में microglia और मैक्रोफेज के बीच कार्यात्मक भेद प्रवाह cytometry, जीन चिप सरणी विश्लेषण और भविष्य में बहुत उपयोगी साबित होगा जो काइमेरावाद विधियों 24,26,41-44, का उपयोग करके पहचाना जा शुरुआत कर रहे हैं। इन दो प्रकार की कोशिकाओं को अलग करने के लिए मुश्किल रहता है, उनके अद्वितीय कार्य को समझने सीएनएस के भीतर दोनों microglia और मैक्रोफेज शामिल है कि विकारों के अधिक लक्षित उपचार के लिए अग्रणी में महत्वपूर्ण है।
रीढ़ की हड्डी में घाव के भीतर सेलुलर बातचीत का विवरण मुख्य रूप से सेल संस्कृति मॉडल शामिल अध्ययन से आया है। इस घ हैएक जीवित प्राणी में एक साथ इमेजिंग दोनों रीढ़ की हड्डी घाव और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ शामिल चुनौतियों के लिए UE। अलग-अलग प्रकार और गंभीरता की रीढ़ की हड्डी में चोट के वर्तमान कृंतक मॉडल कुचलन मॉडल 45,46, पिन चुभन चोटों 2, पंगु बनाना 47, और यहाँ 16,18,48 वर्णित पृष्ठीय स्तंभ कुचलने चोट शामिल हैं। तानिका में सूजन की चोट की गंभीरता के साथ बढ़ जाती है और धारावाहिक इमेजिंग के लिए विंडोज या सर्जरी के आरोपण के लिए अद्वितीय चुनौतियों बन गया है। इन चुनौतियों में से कुछ phagocytic कोशिकाओं की घुसपैठ के साथ ही शल्य साइट से अधिक रेशेदार ऊतकों की पीढ़ी में शामिल हैं। पृष्ठीय स्तंभ कुचलने चोट का अध्ययन करने के लिए यहां किया जाता है के रूप में इन मुद्दों में से कुछ, छोटे घावों बनाने और ड्यूरा और बाद में फिर से खोलने की सर्जरी के लिए अनुमति देने के लिए paraspinous मांसपेशियों के बीच गैर-immunogenic सर्जिकल ड्रेसिंग के साथ उजागर रीढ़ की हड्डी को कवर द्वारा दूर किया जा सकता है । स्पिन की छवि ही पृष्ठीय भाग करने की क्षमताकुचलन मॉडल मुख्य रूप से अक्सर चोट 45,49 के बाद विशेष रूप से जल्दी समय बिंदुओं पर, पृष्ठीय स्तंभों की सबसे पृष्ठीय भाग बख्शते, केंद्रीय कॉर्ड को नुकसान हो के बाद से अल कॉर्ड भी, चोट के चुनाव को सीमित करता है। इसलिए, हम घाव के भीतर और घाव को axonal सापेक्ष स्थिति के लिए आसान मात्रा का ठहराव के लिए सेल आंदोलन का अवलोकन दोनों के लिए उपयोगी है कि एक साफ, repeatable, आयताकार आकार का घाव है कि पैदावार एक साधारण चोट मॉडल का वर्णन है।
वास्तविक समय में विकृति आगामी दौरान उनके मूल ऊतक डिब्बों में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की इमेजिंग बातचीत बहुत रुचि उत्पन्न किया है। सीएनएस, सेल सेल संपर्क के घने नेटवर्क के भीतर और आसन्न कोशिकाओं के साथ संकेत सामान्य कार्य के लिए और सीएनएस विकृति को समझने के लिए आवश्यक हैं। यहाँ, हम रीढ़ की हड्डी में एक यांत्रिक घाव के भीतर सेलुलर आंदोलन के अवलोकन के लिए 2 फोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के उपयोग का वर्णन किया। सर्जरी और ऊतक तैयारी की गुणवत्ता के अलावा, ऊतक के यांत्रिक स्थिरता सफल समय चूक माइक्रोस्कोपी, गति विरूपण साक्ष्य साँस लेने से रीढ़ की हड्डी की विशेष रूप से अलगाव के लिए सर्वोपरि है। स्थिरता जानवर के दिल की दर या सांस लेने से मेल खाती है कि एक विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे रीढ़ की हड्डी के आंदोलन के लिए देख द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। सर्जरी प्रदर्शन और भी इमेजिंग शुरुआत से ठीक पहले, जबकि स्थिरता दोनों मूल्यांकन किया जाना चाहिए। एनिमा हैंएल समायोजन रीढ़ की हड्डी clamps के स्थान और तंगी के लिए किया जाना चाहिए, स्थिर नहीं है। अस्थि मज्जा कल्पना दृष्टिकोण के साथ युग्मित सेल प्रकार विशिष्ट फ्लोरोसेंट संवाददाता माउस मॉडल microglia और एक्सोन बनाम monocytic कोशिकाओं की पहचान की अनुमति दी है। पिछले अध्ययनों से रक्त व्युत्पन्न monocytes और नहीं microglia यहां 43 में वर्णित पद्धति का उपयोग कर आघात के बाद माध्यमिक axonal क्षति के लिए जिम्मेदार हैं कि पता चला है। Dextran संयुग्मित पोत डाई दोनों स्थलों प्रदान करने और पोत अखंडता में उल्लंघनों की पहचान करने के पोत की पहचान के लिए अनुमति देता है। उपयुक्त फ्लोरोसेंट संवाददाता माउस मॉडल का चयन वांछित सेल प्रकार की उचित पहचान imaged किया जा करने की अनुमति के लिए महत्वपूर्ण है।
किए जा रहे अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं कि फ्लोरोसेंट माउस मॉडल का विकास भी प्रयोगों की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। CX3CR1 / + GFP के दो phagocytic आबादी के बीच भेद </sup> सीएनएस में कोशिकाओं को पारंपरिक रूप से मुश्किल हो गया है। यहाँ दिखाया गया है, एक आम प्रतिरक्षात्मक तकनीक, विकिरण काइमेरा, अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज से रेडियो प्रतिरोधी, सीएनएस निवासी microglia भेद करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। विकिरण प्रक्रिया सेल phenotypes रक्त मस्तिष्क बाधा को नुकसान पहुंचा और बदल करने की क्षमता है, तो इस मॉडल का उपयोग सावधानी से विचार किया जाना चाहिए। इन परिवर्तनों की हद तक विकिरण खुराक के रूप में अच्छी तरह से वसूली की अवधि की अवधि के साथ अलग है, और विभिन्न भड़काऊ मॉडल पर उनके प्रभाव को पूरी तरह से अध्ययन नहीं किया गया। सीएनएस रक्त मस्तिष्क बाधा पर विकिरण के प्रभाव विकिरण के दौरान सिर परिरक्षण द्वारा कम किया जा सकता है, और इस रीढ़ की हड्डी सीधे 52 परिरक्षित नहीं है, भले ही विकिरण के बाद रीढ़ की हड्डी में सेल घुसपैठ में कमी दर्ज की गई है। यहाँ हम कल्पना पीढ़ी का एक परिणाम के रूप में स्थिर अवस्था में सीएनएस में घुसपैठ कोशिकाओं की संख्या सुन्न करने के लिए इसके विपरीत में नगण्य है कि मनायाघाव में प्रवेश कोशिकाओं के एर। विचार करने के लिए अन्य वैकल्पिक मॉडल दवा प्रेरित काइमेरा 52 या parabiotic माउस मॉडल 53 में शामिल हैं।
यहाँ, हम दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवि के लिए आसान है कि रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय सफेद बात करने के लिए एक घाव में यह परिणाम है कि एक विशिष्ट, सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य छोटी सी चोट मॉडल प्रस्तुत किया है। इस विधि को भी साहित्य में पूरक तय ऊतक विश्लेषण 16,18,43,48,54 के साथ युग्मित किया गया है कि पृष्ठीय कॉलम में axonal dieback की डिग्री परख करने के लिए एक quantifiable घाव प्रदान करता है। इस मॉडल में, जानवरों केवल न्यूनतम घाटे को प्रदर्शित करने और चोट के बाद कोई विशेष देखभाल की आवश्यकता होती है। यहाँ वर्णित पृष्ठीय स्तंभ कुचलने चोट और इमेजिंग तकनीक के उपयोग के भविष्य के अध्ययन रीढ़ की हड्डी की चोट के लिए इलाज की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए शक्तिशाली स्क्रीनिंग उपकरण हो सकता है। इन उपचार छोटे अणु निरोधक, दवाओं, सेल के उत्पादों, ऊतक ग्राफ्ट और मिश्रित उपचार शामिल हो सकते हैंएस। मैक्रोफेज, microglia और न्यूरॉन्स के बीच परस्पर क्रिया भी एकाधिक काठिन्य, ट्यूमर, दिमागी बुखार और amyotrophic पार्श्व काठिन्य सहित रीढ़ की हड्डी में अन्य रोग मॉडल, में एक भूमिका निभा सकती हैं, और इस तकनीक के रूप में अच्छी तरह से इन बीमारियों के अध्ययन में उपयोगी हो सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
The following agencies provided critical funding support for this study: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick’s Foundation (A.Y.H.), Alex’s Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle’s Angel Foundation (A.Y.H.) and Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). The authors are thankful for the indispensable help of Jerry Silver and Sarah Busch in learning the Dorsal Column Crush (DCC) injury. The authors are also grateful to Jingquang You, Elisabeth Hare and Hongmei Hu for technical help with genotyping and Ross Anderson for mounting the spinal stabilizing unit.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CX3CR1 GFP mice | Jackson laboratories | 5582 | |
Thy-1 YFP H mice | Jackson laboratories | 3782 | |
Mouse pie cage | Braintree Scientific | MPC 2 set | |
60mm2 petri dish | Corning | 430166 | For bone marrow isolation |
Falcon 40 um cell filter | Fisher Scientific | 08-771-1 | For bone marrow isolation |
1x15mL and 1x50mL conical tube | Fisher Scientific | For bone marrow isolation | |
16 gauge needle | BD | 305177 | For bone marrow isolation |
1ml syringe | BD | 309628 | For bone marrow isolation |
ACK lysis buffer | Gibco | A10492-01 | For bone marrow isolation |
HBSS | Gibco | 1E+07 | For bone marrow isolation |
RPMI media | Sigma | R8758 | For bone marrow isolation |
F4/80 antibody | Ebioscience | 12-4801 PE | For FACS verification of chimeras |
30-gauge insulin syringe | BD | 328280 | For tail vein injection |
Spinal Cord Clamps | Narshinge | STS-A | For imaging |
Ortho-Jet Dental Acrylic powder | Lang Dental | REF1320 | For imaging |
Ortho-Jet Dental Acrylic liquid | Lang Dental | REF1404 | For imaging |
Gelfoam gelatin sponges | Pfizer | 9E+06 | For imaging |
4-0 Ethilon sutures | Ethilon | 1667G | For surgery |
Reflex Clips, 7mm | Kent Scientific | INS750344 | For surgery. Sterilize before use |
Iris Scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | For surgery |
45/5 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-35 | For surgery |
Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | For surgery |
30 gauge needle | BD | 305106 | For making access holes in dura |
Forceps Dumont #4 Biology tips | Dumont | 11242-40 | For surgery |
Needle Drivers | Fine Science Tools | 12002-12 | For surgery |
Michel Wound Clip Forceps | Kent Scientific | INS700753 | For surgery |
Wound clip remover | Fine Science Tools | 12033-00 | For surgery |
O-rings for Forceps | Fine Science Tools | 11200-00 | For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately |
Cordless Rechargable Animal trimmer | Wahl | Series 8900 | for surgery |
Vetbond | 3M | 1469SB | For surgery |
Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 | For surgery |
Nair Hair remover lotion | Church & Dwight Co., Inc. | NRSL-22329-05 | For surgery |
Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | Drugs – for surgery |
Marcaine | Henry Schein | 6E+06 | Drugs – for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously |
Bupernex | Henry Schein | 121-7793 | Drugs – for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg |
aCSF | Chemicals from Sigma | 119 mm NaCl | For surgery |
26.2 mM NaHCO3 | From Cold Spring Harbor Protocols | ||
2.5 mM KCl | |||
1 mM NaH2PO4 | |||
1.3 mM MgCl2 | |||
10 mM glucose | |||
TRITC-dextran 150,000 MW | Sigma | T1287 | For intravenous administration to label vasculature |