FIMは、Cなどの小さな移動物体を追跡するために設計された新規、費用効果的なイメージングシステムである虫、プラナリアやショウジョウバエの幼虫。添付FIMTrackプログラムが高速で効率的なデータ分析を提供するように設計されている。一緒に、これらのツールは、行動特性の高スループット分析を可能にする。
神経細胞のネットワーク機能の解析は、行動特性の信頼性の高い測定が必要です。自由に動く動物の行動はある程度可変であるため、多くの動物は、統計的に有意なデータを得るために、分析されなければならない。これは次に歩行パターンのコンピュータ支援自動化された定量化が必要です。ほぼ半透明と小さな移動物体の高コントラスト画像を得るために、FIMと呼ばれる減衰全反射に基づく新規なイメージング技術を開発した。このセットアップでは、動物は、基礎となるだけクローリング面と接触の非常に特定の位置に赤外光で照明される。この方法は、非常に高いコントラストの画像が得られる。続いて、これらの高コントラスト画像は、確立された輪郭追跡アルゴリズムを使用して処理される。これに基づいて、我々は、定量的運動の多種多様を記述するために必要な機能の数を抽出するのに役立つFIMTrackソフトウェアを開発特性。このソフトウェアパッケージの開発中に、我々はさらにモジュールを簡単に追加できるように、オープンソースのアーキテクチャ上の私たちの努力を集中した。プログラムは、プラットフォームに依存しないで動作し、データ解析を介してユーザを案内する直感的なGUIを伴う。すべての運動パラメータ値は、更なるデータ分析許可のcsvファイルの形式で与えられている。また、追跡ソフトウェアに統合結果ビューアは、対話的に見直し、刺激の統合の際に必要になる可能性があるとして、出力を調整する機会を提供する。 FIMとFIMTrackの電力がショウジョウバエ幼虫の運動を研究することによって実証される。
ほとんどの動物は、高度に洗練された制御された様式で移動する能力を有している。遺伝的基礎基盤となる歩行制御を解読するためには、定量的に異なる行動パターンを評価するために必須です。この点において、ショウジョウバエの理想的なモデルとして役立つことができる。自由にショウジョウバエ1-4そそるが、ショウジョウバエの幼虫のクロールされる飛行の追跡は、比較的低速で二次元的に発生し、容易に監視することができる。適切な照明と組み合わせたカメラベースのセットアップは、画像5を取得するために使用されている。入射光または透過光の両方が行動実験6,7で使用される。しかし、幼虫と幼虫の動きをクロール表面忠実な記録の可能性光反射の半透明の体に挑戦することができます。このような問題を克服するために、いくつかの複雑な方法が考案されている。最近では、暗視野照明は、前景/背景続きを強化するために導入されたRAST 8。カメラベースの記録に代わるものとして、レンズレス光イメージングおよび画像センサレスオンチップの取得技術は9-11導入されている。
いくつかのトラッキングプログラムが市販のソフトウェア12とカスタムソリューションを含む、最近導入された。ハイスループット追跡プログラムの例としては、マルチワームトラッカー(MWT)13とMultianimal歩行とトラック(MAGAT)8である。どちらも、衝突動物が複数の新しい動物のアイデンティティにつながるように、複数の動物は、単一のオープンフィールドアリーナで追跡できることを、共通している。この制限を克服するために、マルチウェルセットアップは個々のウェル14内に12匹の分離を導入した。単一の個人の運動の正確な定量化は、顕微鏡15と組み合わせて可動追跡ステージを使用することによって達成することができる。しかし、すべてのこれらのアプローチのいずれか費用非効率的であり、欠如、十分な再溶液またはハイスループット表現型のために時間がかかりすぎる。
フラ全反射(FTIR)16( 図1)に基づいて、上述の限界を克服するために、我々が開発したFIM(FTIRベースのイメージング法)。この新しいイメージング手法は、前例のない高コントラストを提供し、さらには動物16クローリングのマルチカラー記録を可能にする。この便利で効果的な方法の基本原理は簡単です。アクリルガラス板は、光(赤外線例えば、875 nm)とが殺到している。によるアクリルガラスと空気の屈折率が異なるために、光は全ガラス/空気界面で反射される。アクリルガラスの加熱なしには16に注目されていない。より高い屈折率を持つオブジェクトは、日当たりのテーブルに触れた場合のみ、これらのオブジェクトを入力する点灯することができます。動物が表面に触れた場合は、光が反射され( 図1)の下方から撮像することができる。結果は、唯一の接触動物の面積は、全体的な黒の背景に詳細なイメージングを可能に明るいスポット、として表示されます。このように、FIM-イメージングはコンピュータビジョンアルゴリズムのための完全な映画を記録することができます。 FIMのシンプルかつ堅牢な使用が今手に複雑な動物の行動の詳細な高スループット分析をもたらし情報処理研究するために使用することができます。 例えば、嗅覚8、16、。ビジョン17または熱感覚18。
熱刺激の統合基盤となる物理的原理1. FIMセットアップ図。 (A)FIMセットアップ。照度は、フロントパネルで調整することができる。(B)熱刺激を送達するために、ブラック、アルミニウム板を塗装両側に温水と冷水で灌流し、寒天表面上に2mmの置かれているそれ自体は、2mmの厚さである。勾配は、放熱板との温度差により寒天上で確立される(C)減衰全反射の物理的原理:アクリルガラス板が赤外光によって照明される。 θ1、θ2、θ3は、光の反射角度を示している。 N A、N 1、N 2およびn 3はそれぞれ空気、アクリルガラス、寒天と幼虫の屈折率を表し、不平等N A <N 1 <N 2 <N 3を果たす。屈折による、反射角は、移行中に変化する。角が臨界角以下であれば、光はもはや反映されていない、層を通過することができ、下からキャプチャすることができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
SPFIMによって分析することができるプロセスのectrumが広い。さらなる調整なしで、FIM画像化は、ショウジョウバエのすべての幼虫( 図5B)を監視するために使用することができ、またはショウジョウバエ成虫19のフットプリントを追跡するために使用することができる。 C.の同様に、軌跡エレガンスまたはプラナリア扁形動物の移動が容易に( 図5C)を記録することができる。真菌菌糸または根毛成長のさえ解析が実現可能な19表示されます。我々の現在のFIMのセットアップでは、4×16赤外線発光ダイオード(IR-LED)は( 図1)トラッキングテーブルと呼ばれる、32×32 cm 2のアクリルガラス板に組み込まれている。 IR-LEDの強度を容易にパルス幅変調(PWM)を介して回路に接続されたマイクロコントローラによって行うことができるトラッキングテーブル上の対象物の重量に応じて調整される。 FIMは、照明強度の広い範囲にわたって非常に高いコントラストの画像が得られる。重要なことは、それGENすでに低い全体赤外線irridationで優れた結果をerates。
赤外線フィルタ付きカメラは、セットアップへの追加的な刺激の統合を可能にするトラッキングテーブル、下に配置されている。熱刺激は容易に放熱板によって適用することができ、光刺激は、LCDプロジェクターによって適用される。また、臭気物質は、簡単な蓋8によって勾配に含有させることができる。熱勾配の実験のために、放熱板がそれぞれ両側に冷温水で灌流し、幼虫( 図1B)2mm上方に配置される。
高コントラスト、高品質ムービーの生成は、このように、我々は画像から特徴の大きなセット( 図2)を抽出するFIMTrackソフトウェアを実装し、洗練されたコンピュータベースの画像解析のための可能性を開く。まず6主な機能は、動物( 図3A)の輪郭から定義された。これらの機能は、ベースラインを提供与えられた時点( 図3B)での動物の形状と特 定の刺激でその位置を記述6二次の機能の更なる計算のために。現在、9三次特徴は時間的側面 を統合するため、プライマリとセカンダリの機能( 図3C)と一緒に動物の運動を特徴付けるされているように計算されます。
図2. FIMTrackの概要、アルゴリズム的なワークフローと幼虫の表現。 (A)どのようFIMTrackを使用します。画像がロードされます。グレー値のしきい値および単一の幼虫を定義する幼虫のサイズのしきい値を設定する必要があります。幼虫のエリアは[分サイズ、最大サイズ]でなければなりません。トラッキングがハイライトされたボタンによって開始されます。(B)のトラッキングのワークフローを。スタートボタンがクリックされた後、背景画像caがあるlculated(時間をかけて、最小限の強度)。限り左フレームがあるように、幼虫はグレーのしきい値と最小値と最大サイズのしきい値に基づいてセグメント化されている。幼虫の表現が計算されるすべてのセグメント化のための((C)と比較)。有効トラックが利用可能である場合、それぞれの新しいモデルは、所与の軌跡に関連している。最後のフレームに達した場合、後処理を確定する出力生成に続いて行われる。(C)幼虫の表現。動物は、頭と尾のポイント(HとT)から構成されています。これらの点の間に脊椎点sの任意の奇数iは 、半径r iを設定することができる。また、質量mと角γを曲げ本体の中心が計算される。いくつかの運動関連パラメータは、紫色の線で描かれている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
行動神経科学では定量的に複雑な行動特性を解読することが必須である。したがって、多数の個体は、高分解能で観察する必要があり、自動化された手順は、統計分析のために必要とされる。ここでは、FIM画像化は、動物の広範囲の運動を監視する手段を提供する、新規な、簡単かつ堅牢な画像機構を説明する。 FIM画像機構の有効性は、ショウジョウバエの幼虫、プラナリア扁形動物およびCを用いて試験した虫ワーム 。 FIM技術は、脳、気管、消化管や前胃などの動物のさえ内部構造を、検出するために本質的に高いコントラストを提供します。それらは自動的に動物19の向きを特定するのに役立つことができるように、重要なことに、これらの内部構造が堅牢に識別される。
動画の画質をクロール表面上の水の過剰量によって影響され得る。したがって、非常に重要です寒天の水分を制御します。表面に古すぎる寒天またはあまりにも多くの水がアーティファクトを引き起こす可能性があります。同様に、気泡がクロール表面に含まれていないことを確認してください。一般的には、十分に準備寒天表面には4時間の映画を記録することができます。
により、基礎となる物理的原理にFIMイメージングは、優れた画像品質で、その結果、ほとんどノイズのない画像記録を生成します。これは次に、その後のコンピューターベースの画像分析を容易にし、高スループットを可能にする。しかし、方法論は直接寒天表面に連絡し、動物の分析に限定されている。追跡ソフトウェアは、ドーナツ形状を形成した動物によって挑戦されている。バイナリインジケータがドーナツ形状を認識したが、間違った背骨が計算されることがあります。
起因するトラッキングテーブルデュアル、トリプルカラーイメージングのモジュール構造に到達している。また、付加的な刺激(光、臭気物質、電気的または機械的刺激)を容易にすることができるデル上からivered。 FIMイメージングの電力に一致するように設計FIMTrackプログラムが容易にショウジョウバエの幼虫、C.を追跡するために採用することができる虫やプラナリア。こうしてと、その単純かつ安価な構成に(http://FIM.uni-muenster.deを参照)、FIM画像化は、生物医学的用途の幅広い可能であり、特に緊急ハイスループット試験を必要として可能にする。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、FIMセットアップの建設に助けをこのプロジェクトを開始したS·トーマス、J.ヘルマンおよびU Burgbacherに感謝しています。この作品は、DFG(SFB 629 B6)によって資金を供給された。
Name of the Material/Equipment | Source | Catalog Number | Comments |
FIM setup | Custom | details for construction or purchase of setups is available upon request | |
Acrylic glass plate | Custom | Additional for agar pouring | |
Heat radiator plate | Custom | Aluminum plate (paintet in matt black) perfusable on opposing sites with adjustable mounting | |
Water calorifier/cooling pumps and hoses | Custom | based on GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) and Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013) | |
Standard Camera (4 MP) | Basler | acA2040-25gm | Camera defaultly used for the FIM setup |
Test Camera (1.4 MP) | QImaging | 1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO) | Camera used for comparison |
Test Camera (0.8 MP) | Point Grey | Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS) | Camera used for comparison |
Test Camera (0.3 MP) | Sony | PS Eye USB2.0 camera | Camera used for comparison |
Computer | Custom | equipped with at least i5 Intel processor or better, 16 GB RAM and sufficient HDD storage space [>1TB] | |
Standard Fly food | Custom | ||
Standard Fly vials 135 ml | Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany | 78,895 | |
Petri dishes 9cm | Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany | 821,473 | |
Ultrapure deionized water | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | Synergy | |
NaCl | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 3957.2 | |
Food grade agar | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A0917,5000 | |
Paintbrush (small and large) | Milan | Aquarell 310 Size 0 and 2 | |
Pyrometer | Trotec | BP20 |