FIM är en roman, kostnadseffektivt avbildningssystem utformat för att spåra små rörliga föremål såsom C. elegans, planaria eller Drosophila larver. Den medföljande FIMTrack Programmet är utformat för att leverera snabb och effektiv dataanalys. Tillsammans utgör dessa verktyg kan hög genomströmning analys av beteendemässiga egenskaper.
Analysen av neuronala nätverk funktion kräver en tillförlitlig mätning av beteendemässiga egenskaper. Eftersom beteende fritt rörliga djur är variabel till en viss grad, många djur måste analyseras, för att erhålla statistiskt signifikanta data. Detta kräver i sin tur en datorstödd automatiserad kvantifiering av locomotion mönster. För att få bilder med hög kontrast på nästan genomskinliga och små rörliga föremål, var en ny bildteknik baserad på frustrerad total inre reflektion som heter FIM utvecklas. Med den här inställningen är djur endast upplyst med infrarött ljus vid mycket specifika position kontakt med den underliggande krypande ytan. Denna metod resulterar i mycket höga kontrastbilder. Därefter är dessa bilder med hög kontrast bearbetas med etablerade kontur spårning algoritmer. Utifrån detta har vi utvecklat den FIMTrack mjukvaran, som tjänar till att extrahera ett antal funktioner som behövs för att kvantitativt beskriva en stor variation av locomotionegenskaper. Under utvecklingen av denna mjukvara, vi fokuserat våra insatser på en öppen källkod-arkitektur tillåter enkel tillägg av ytterligare moduler. Programmet fungerar plattformsoberoende och åtföljs av ett intuitivt GUI vägleda användaren genom dataanalys. Alla locomotion parametervärden ges i form av CSV-filer som möjliggör ytterligare dataanalyser. Dessutom ett resultat Viewer integrerad i spårningsprogram ger möjlighet att interaktivt granska och justera utgångs, som kan behövas under stimulans integration. Kraften i FIM och FIMTrack demonstreras genom att studera rörelse i Drosophila larver.
De flesta djur har förmåga att röra sig i en mycket sofistikerad och kontrollerat sätt. För att dechiffrera den genetiska grunden underliggande rörelsekontroll är det obligatoriskt att kvantitativt bedöma olika beteendemönster. I detta avseende kan Drosophila fungera som en idealmodell. Spårning av fritt flygande Drosophila kittlande 1-4 men krypa av Drosophila larver sker i två dimensioner vid relativt låg hastighet och kan således övervakas lätt. Kamerabaserade uppställningar i kombination med lämplig belysning används för att få bilder 5. Både tillbud eller överförd ljuset används i beteendeexperiment 6,7. Men på grund av den halvgenomskinliga kropp larver och möjliga ljusreflektioner av krypande ytan trogna inspelning av larver rörelser kan vara en utmaning. För att övervinna dessa problem, har vissa komplexa metoder tagits fram. Nyligen var mörkfältsbelysning införts för att förbättra förgrunden / bakgrund fortsRast 8. Som ett alternativ till kamerabaserat inspelning, lins mindre optisk avbildning och bildsensorn lösa on-chip förvärvs tekniker har införts 9-11.
Flera spårningsprogram har införts nyligen, inklusive kommersiellt tillgängliga program 12 och anpassade lösningar. Exempel på hög kapacitet spårningsprogram är Multi Worm Tracker (MWT) 13 och Multianimal gång och Track (Magat) 8. Båda har gemensamt, att flera djur kan spåras i ett enda frilands arenan så att kolliderande djur leder till flera nya djur identiteter. För att övervinna denna begränsning, har en multi-brunninstallations infördes separera 12 djur i enskilda brunnar 14. Exakt kvantifiering av förflyttning av enskilda individer kan uppnås genom användning av en rörlig spårningssteget i kombination med ett mikroskop 15. Men alla dessa metoder är antingen kostnads ineffektiva, brist tillräckligt relösning eller alltför tidskrävande för hög genomströmning fenotypning.
För att övervinna de ovan nämnda begränsningarna, har vi utvecklat FIM (FTIR-baserad avbildningsmetod) baserad på Frustrerad total inre reflektion (FTIR) 16 (figur 1). Denna nya avbildningsmetoden ger en oöverträffad hög kontrast och även tillåter flerfärgade inspelning av krypande djur 16. Den underliggande principen för denna behändiga och effektiv metod är lätt. En akrylglasplatta är översvämmad med ljus (t.ex. 875 nm infrarött). På grund av olika brytningsindex för akrylglas och luft, är ljuset totalreflekteras vid glas / luftgräns. Ingen uppvärmning av akrylglas noteras 16. Endast om objekt med ett högre brytningsindex röra ljusa bord, kan lysa in i dessa objekt. Om djuren röra vid ytan, är ljus som reflekteras och kan fångas underifrån (fig 1). Följaktligen endast kontaktenområde av djuren verkar som en ljuspunkt, vilket möjliggör detaljerad avbildning med en total svart bakgrund. Således låter FIM-avbildning för att spela in perfekta filmer för datorseende algoritmer. Den enkla och robusta användning av FIM ger nu detaljerad hög genomströmning analys av komplexa djurs beteende i räckvidd och kan användas för att studera informationsbehandling: t.ex. olfaction 8, 16; Visionen 17 eller thermosensation 18.
Figur 1. FIM setup med värme stimulans integration och bakomliggande fysikaliska principer. (A) Den FIM setup. Belysning intensitet kan regleras på frontpanelen. (B) För att kunna leverera en värme stimulans, en svartmålad aluminiumplåt, perfusion med varmt och kallt vatten på båda sidor, placeras 2 mm ovanför agarytan somsjälv är 2 mm tjock. Gradienten är etablerad på värmeradiatorplattan och agar av temperaturskillnader (C) Den fysikaliska principen om frustrerad total inre reflektion. En akrylglasplatta är upplyst av infrarött ljus. θ 1, θ 2, och θ 3 indikerar ljusreflektionsvinklar. n A, n 1, n 2 och n 3 betecknar brytningsindex för luft, akrylglas, agar och larven respektive och uppfyller olikheten n A <n 1 <n 2 <n 3. På grund av refraktion, ändrar reflektionsvinkeln under övergång. Om vinkeln är under den kritiska vinkeln, är ljuset inte reflekteras längre, kan passera genom lagren och kan fångas underifrån. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den spectrum av processer som kan analyseras med FIM är bred. Utan några ytterligare justeringar, kan FIM avbildning användas för att övervaka alla larvstadier Drosophila (Figur 5B) eller kan användas för att följa mul-utskrifter av vuxna Drosophila 19. Likaså, banorna för C. elegans eller förflyttning av planarian plattmaskar kan enkelt spelas in (figur 5C). Även analysen av svamp hypha eller rot hårväxt verkar genomförbart 19. I vår nuvarande FIM setup, är 4 x 16 infraröda lysdioder (IR- LED) integreras i en 32 x 32 cm 2 akrylglasplatta, som kallas spårningstabellen (Figur 1). Intensiteten för IR-lysdioder justeras beroende på vikten av föremålen på spårningstabellen, som lätt kan göras av en mikrostyrenhet som är ansluten till kretsen via pulsbreddsmodulering (PWM). FIM ger mycket höga kontrastbilder över ett brett område av belysningsintensitet. Viktigt är det allmbetar utmärkta resultat på redan låg total infraröd irridation.
En kamera med en infraröd filter placeras under spårningstabellen, vilket möjliggör integration av andra stimuli i installationen. Värme stimuli kan lätt appliceras med en värmeradiator platta och ljusstimuli tillämpas av en LCD-projektor. Också odörer kan ingå i övertoningar med enkla lock 8. För värme lutning experiment, är värmestrålare plattan perfusion med varmt och kallt vatten på båda sidor respektive och placerade 2 mm ovanför larver (Figur 1B).
Den generation av hög kontrast, högkvalitativa filmer öppnar möjligheten för sofistikerad datorbaserad bildanalys, vilket vi genomfört FIMTrack programvara för att extrahera en stor uppsättning funktioner från bilder (Figur 2). Första sex primära funktioner definierades från konturen av djuret (Figur 3A). Dessa funktioner ger baslinjenför vidare beräkning av sex sekundära egenskaper som beskriver djurens form och sin ståndpunkt vid vissa stimuli vid en given tidpunkt (figur 3B). För närvarande är nio tertiära funktioner beräknat att integrerar temporala aspekter och därmed karakterisera locomotion av djuret tillsammans med de primära och sekundära funktioner (Figur 3C).
Figur 2. FIMTrack översikt, algoritmisk arbetsflöde och larv representation. (A) Hur du använder FIMTrack. Bilderna laddas. Grå tröskelvärde och larver storlek trösklar definierar enstaka larver måste ställas in. Larver området måste vara i [min-storlek, max-size]. Spårning startas av den markerade knappen. (B) Spårning arbetsflöde. Efter startknappen klickas, är bakgrundsbilden calculated (minimala intensiteter över tid). Så länge det finns ramar kvar, är larverna segmenterad utifrån den grå tröskeln och min- och max-storlek tröskel. För alla segmentelarv representationer beräknas (jämför till (C)). Varje ny modell är associerad till en given bana om en giltig spåret är tillgänglig. Om den sista ramen har nåtts, är färdig efterbearbetning klar, följt av den utgående generationen. (C) Larv representation. Djuret består av ett huvud och en svans punkten (H och T). Mellan dessa punkter ett godtyckligt udda antal rygg poäng s jag kan ställas in med en radie ri. Dessutom är masscentrum m och huvudkroppen böjningsvinkel γ beräknas. Flera rörelserelaterade parametrar skissade av lila linjer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
I beteende neurovetenskap är det obligatoriskt att kvantitativt dechiffrera komplexa beteendemönster. Således måste ett stort antal individer observeras med hög upplösning och automatiserade rutiner behövs för statistisk analys. Här är FIM avbildning beskrivs, en roman, enkel och robust bildinställningar, vilket ger möjlighet att övervaka förflyttning av ett brett spektrum av djur. Effekten av FIM avbildning installationen testades med Drosophila larver, planarian plattmaskar och C. elegans maskar. FIM teknik ger hög inneboende kontrast för att upptäcka även interna strukturer av djur, såsom hjärnan, luftstrupe, tarmen eller proventriculus. Viktigt är dessa interna strukturer robust identifieras så att de kan tjäna till att automatiskt identifiera orienteringen av djuret 19.
Kvaliteten på filmerna kan påverkas genom överdriven mängd vatten på krypande ytan. Således är det kritiskt attstyra fukten av agar. För gammal agar eller för mycket vatten på ytan kan orsaka artefakter. Likaså se till att inga luftbubblor ingår i krypande ytan. I allmänhet ger en väl förberedd agarytan filminspelning under 4 timmar.
På grund av de underliggande fysikaliska principer FIM avbildning genererar nästan brusfria bildinspelningar, vilket resulterar i en suverän bildkvalitet. Detta i sin tur underlättar efterföljande datorbaserad bildanalys och möjliggör hög genomströmning. Dock är den metod begränsas till att analysera djur som direkt kontakta agarytan. Den mjukvara utmanas av djur som utgör en munkform. Även en binär indikator erkänner munkform, kanske fel ryggrad beräknas.
På grund av den modulära konstruktionen av spårningstabellen dubbla och tredubbla färgbilder är inom räckhåll. Dessutom kan andra stimuli (ljus, doftämnen, elektriska eller mekaniska stimuli) lätt delivered ovanifrån. Den FIMTrack program för att matcha kraften i FIM avbildning kan lätt antas att spåra Drosophila larver, C. elegans eller planarians. (Se http://FIM.uni-muenster.de), är alltså och på grund av dess enkla och billig konstruktion FIM avbildning möjligt för ett brett spektrum av biomedicinska tillämpningar, särskilt tillåter akut behov hög genomströmning studier.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma för S. Thomas som har initierat detta projekt, J. Hermann och U. Burgbacher om hjälp i byggandet av FIM installationen. Detta arbete har finansierats av DFG (SFB 629 B6).
Name of the Material/Equipment | Source | Catalog Number | Comments |
FIM setup | Custom | details for construction or purchase of setups is available upon request | |
Acrylic glass plate | Custom | Additional for agar pouring | |
Heat radiator plate | Custom | Aluminum plate (paintet in matt black) perfusable on opposing sites with adjustable mounting | |
Water calorifier/cooling pumps and hoses | Custom | based on GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) and Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013) | |
Standard Camera (4 MP) | Basler | acA2040-25gm | Camera defaultly used for the FIM setup |
Test Camera (1.4 MP) | QImaging | 1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO) | Camera used for comparison |
Test Camera (0.8 MP) | Point Grey | Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS) | Camera used for comparison |
Test Camera (0.3 MP) | Sony | PS Eye USB2.0 camera | Camera used for comparison |
Computer | Custom | equipped with at least i5 Intel processor or better, 16 GB RAM and sufficient HDD storage space [>1TB] | |
Standard Fly food | Custom | ||
Standard Fly vials 135 ml | Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany | 78,895 | |
Petri dishes 9cm | Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany | 821,473 | |
Ultrapure deionized water | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | Synergy | |
NaCl | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 3957.2 | |
Food grade agar | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A0917,5000 | |
Paintbrush (small and large) | Milan | Aquarell 310 Size 0 and 2 | |
Pyrometer | Trotec | BP20 |