FIM er en roman, omkostningseffektiv imaging system designet til at spore små bevægelige genstande såsom C. elegans, Planaria eller Drosophila-larver. Den medfølgende FIMTrack Programmet er designet til at levere hurtig og effektiv dataanalyse. Tilsammen udgør disse værktøjer giver high-throughput analyse af adfærdstræk.
Analysen af neuronal netværk funktionen kræver en pålidelig måling af adfærdstræk. Da adfærd frit bevægelige dyr er variabel til en vis grad, har mange dyr, der skal analyseres, for at opnå statistisk signifikante data. Dette kræver en computer bistået automatiseret kvantificering af bevægelseskomponenter mønstre. For at opnå høj kontrast billeder af næsten gennemsigtige og mindre bevægelige objekter, blev en ny imaging teknik baseret på frustrerede total intern refleksion kaldet FIM udvikles. I denne opsætning er dyrene kun belyst med infrarødt lys i det særlige situation for kontakt med den underliggende crawling overflade. Denne metode resulterer i meget høj kontrast billeder. Efterfølgende er disse høj kontrast billeder forarbejdet ved anvendelse af etablerede kontur sporing algoritmer. Baseret på dette, vi udviklede FIMTrack software, som tjener til at udtrække en række funktioner, der er nødvendige til kvantitativt at beskrive en lang række bevægelseegenskaber. Under udviklingen af denne software pakke, vi fokuseret vores indsats på en open source arkitektur tillader nem tilføjelse af yderligere moduler. Programmet fungerer uafhængig af platform og er ledsaget af en intuitiv GUI vejlede brugeren gennem dataanalyse. Alle bevægelsesevne parameterværdier er givet i form af CSV-filer gør det muligt yderligere dataanalyser. Desuden en Resultater Viewer integreret i tracking software giver mulighed for interaktivt at gennemgå og justere output, som kan være nødvendig under stimulus integration. Effekten af FIM og FIMTrack demonstreres ved at studere bevægelse af Drosophila larver.
De fleste dyr har evnen til at bevæge sig i en meget sofistikeret og kontrolleret måde. At dechifrere det genetiske grundlag underliggende bevægelse kontrol er det obligatorisk at kvantitativt vurdere forskellige adfærdsmønstre. I denne henseende kan Drosophila tjene som en ideel model. Sporing af frit flyvende Drosophila er fristende 1-4 men gennemsøgning af Drosophila larver forekommer i to dimensioner ved relativt lav hastighed og kan således overvåges let. Kamera-baserede setups kombineret med passende belysning bruges til at erhverve billeder 5. Både hændelse eller transmitteret lys anvendes i adfærdsmæssige eksperimenter 6,7. På grund af den halvgennemsigtigt krop larver og eventuelle lysreflekser af kravlende overflade trofaste registrering af larver bevægelser, kan dog være en udfordring. For at overvinde sådanne problemer er der blevet udtænkt nogle komplekse metoder. For nylig blev mørkefeltbelysning indført for at forbedre forgrunden / baggrunden contRast 8. Som et alternativ til kamera-baserede optagelse, linse-mindre optisk billeddannelse og image-sensor-mindre on-chip er blevet indført erhvervelse teknikker 9-11.
Adskillige tracking programmer er blevet indført for nylig, herunder kommercielt tilgængelige software 12 og tilpassede løsninger. Eksempler på højt gennemløb tracking programmer er Multi Worm Tracker (MWT) 13 og Multianimal gang og Track (Magat) 8. Begge har til fælles, at flere dyr kan spores i en enkelt åben felt Arenaen, så kolliderende dyr føre til flere nye dyr identiteter. For at overvinde denne begrænsning blev en multi-brønds setup indført adskillelse 12 dyr i individuelle brønde 14. Præcis kvantificering af bevægelse af enkelte individer kan opnås ved hjælp af en bevægelig sporing fase i kombination med et mikroskop 15. Men er enten omkostningerne ineffektive alle disse tilgange, manglende tilstrækkelig reopløsning eller for tidskrævende for high throughput fænotypebestemmelse.
For at overvinde de ovennævnte begrænsninger, har vi udviklet FIM (FTIR-baserede Imaging Method) baseret på Frustreret total intern refleksion (FTIR) 16 (figur 1). Denne nye imaging tilgang giver en hidtil uset høj kontrast og endda tillader flerfarvede optagelse af kravlende dyr 16. Det underliggende princip i denne handy og effektiv metode er let. En akrylglas plade er oversvømmet med lys (f.eks 875 nm infrarød). På grund af forskellige brydningsindekser akrylglas og luft, lys reflekteres totalt ved glas / luft grænse. Ingen opvarmning af akrylglas bemærkes 16. Kun hvis objekter med et højere brydningsindeks røre lyse bord, kan lyse ind i disse objekter. Hvis dyrene berøre overfladen, er lys reflekteres og kan opfanges nedefra (figur 1). Som følge heraf kun kontaktenområde af dyrene vises som en lys plet, som giver detaljerede billeder med en samlet sort baggrund. Således FIM-imaging gør det muligt at optage perfekte film til computer vision algoritmer. Den enkle og robuste anvendelse af FIM bringer nu detaljeret high throughput analyse af komplekse adfærd dyr i rækkevidde og kan bruges til at studere informationsbehandling: f.eks lugtesansen 8, 16; vision 17 eller thermosensation 18.
Figur 1. FIM setup med varme-stimulus integration og underliggende fysiske principper. (A) FIM setup. Belysning intensitet kan reguleres på frontpanelet. (B) til at levere en varme stimulus, en sort malet aluminium plade, perfunderet med varmt og koldt vand på begge sider, er placeret 2 mm over agaroverfladen somselv er 2 mm tyk. Gradienten er etableret på varmen radiator plade og agaren ved temperaturforskellene (C) Det fysiske princip om frustrerede total intern refleksion:. En akrylglas plade belyst af infrarødt lys. θ 1, θ 2 og θ 3 angiver lysrefleksionsmålinger vinkler. n A, n 1, n2 og n3 angiver brydningsindekserne luft, akrylglas, agar og larven henholdsvis og opfylder uligheden n A <n 1 <n 2 <n 3. På grund af brydning, ændrer refleksion vinkel under forandring. Hvis vinklen er under den kritiske vinkel, er lyset ikke reflekteres mere, kan passere gennem lagene og kan fanges nedefra. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Den spectrum af processer, der kan analyseres ved FIM er bred. Uden yderligere justeringer, kan FIM billeddannelse anvendes til at overvåge alle larvestadier af Drosophila (figur 5B) eller kan bruges til at følge mund- udskrifter af voksne Drosophila 19. Ligeledes baner C. elegans eller flytning af planarian fladorme let kan optages (figur 5C). Selv analyse af svampe hypha eller rod hårvækst forekommer mulig 19. I vores nuværende FIM setup, er 4 x 16 infrarøde lysemitterende dioder (IR- LED'er) integreret i en 32 x 32 cm 2 akrylglas plade, kaldet tracking tabel (figur 1). Intensiteten af IR-LEDs justeres afhængigt af vægten af genstandene på sporing bord, som let kan udføres af en mikro-controller forbundet til kredsløbet via impulsbreddemodulation (PWM). FIM giver meget høj kontrast billeder over en bred vifte af belysning intensiteter. Vigtigt er det, det gende henvender fremragende resultater ved allerede lav samlet infrarød irridation.
Et kamera med et infrarødt filter er placeret under sporing tabel, som giver mulighed for integration af yderligere stimuli i opsætningen. Heat stimuli let kan anvendes af en radiator plade og lette stimuli anvendes af en LCD-projektor. Også duftstoffer kan være indeholdt i farveforløb ved simple låg 8. For varme gradient eksperimenter er radiator plade perfunderet med varmt og koldt vand på begge sider henholdsvis og placeret 2 mm over larver (figur 1B).
Frembringelsen af høj kontrast, høj kvalitet film åbner mulighed for avancerede computerbaserede billedanalyse, således implementeret vi FIMTrack software til at udtrække en stor sæt af funktioner fra billeder (figur 2). Første seks primære funktioner blev defineret ud fra konturen af dyret (figur 3A). Disse funktioner giver basislinjentil yderligere beregning af seks sekundære funktioner der beskriver dyr form og dens stilling på bestemte stimuli på et givet tidspunkt (figur 3B). I øjeblikket er ni tertiære funktioner beregnet, at der integrerer tidsmæssige aspekter og dermed karakterisere bevægelse af dyret sammen med de primære og sekundære funktioner (figur 3C).
Figur 2. FIMTrack overblik, algoritmisk workflow og larver repræsentation. (A) Sådan bruges FIMTrack. Billederne er indlæst. Grå værdi tærskel og størrelsestærskler larver definerer enkelt larver skal indstilles. Det larver skal ligge i [min-størrelse, max-størrelse]. Tracking er startet af den fremhævede knap. (B) Tracking workflow. Når startknappen klikkes, baggrundsbilledet er calculated (minimal intensiteter over tid). Så længe der er frames tilbage, bliver larverne segmenteres ud fra den grå tærskel og de min- og max-størrelse tærskel. For alle segmenter larvestadiet repræsentationer beregnes (sammenlign til (C)). Hver ny model er forbundet til en given bane, hvis et gyldigt spor er til rådighed. Hvis det sidste billede er nået, er ved at færdiggøre efterbehandling færdig efterfulgt af output generation. (C) Larve repræsentation. Dyret består af et hoved og en hale (H og T). Mellem disse punkter et vilkårligt ulige antal rygsøjlen point s kan jeg indstilles med en radius r i. Desuden er centrum for massen m og hoveddelen bøjningsvinkel γ beregnet. Flere motion parametre er skitseret af lilla linjer. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
I Biologisk psykologi er det obligatorisk at kvantitativt dechifrere komplekse adfærdstræk. Er behov Således må et stort antal personer blive observeret ved høj opløsning og automatiserede procedurer til statistisk analyse. Her er FIM billeddannelse beskrevet, en roman, enkel og robust imaging setup, som giver mulighed for at overvåge bevægelse af en bred vifte af dyr. Effekten af FIM imaging setup blev testet under anvendelse Drosophila larver, planarian fladorme og C. elegans orme. FIM teknologi giver iboende høj kontrast til påvisning selv interne strukturer i de dyr, såsom hjerne, trachea, tarmen eller proventriculus. Vigtigere er disse interne strukturer robust identificeres, således at de kan tjene til automatisk at identificere orienteringen af dyret 19.
Kvaliteten af film kan påvirkes af overdreven mængde vand på crawling overflade. Således er det vigtigt atstyre fugten i agar. For gammel agar eller for meget vand på overfladen kan forårsage artefakter. Ligeledes sikre, at ingen luftbobler er inkluderet i crawling overflade. Generelt er en velforberedt agaroverfladen tillader optagelse af film i 4 timer.
På grund af de underliggende fysiske principper FIM billeddannelse genererer næsten støjfrit billede optagelser, hvilket resulterer i en fantastisk billedkvalitet. Dette på sin side letter efterfølgende computerbaseret billedanalyse og muliggør high throughput. Imidlertid er metoden begrænset til analyse af dyr, der direkte kontakt agaroverfladen. Den tracking software udfordres af dyr, der udgør en doughnut form. Selv om en binær indikator genkender doughnut form, kan en forkert rygsøjlen beregnes.
På grund af den modulære opbygning af tracking bordet dobbelt og tredobbelt farve imaging er inden for rækkevidde. Desuden kan yderligere stimuli (lys, lugtstoffer, elektrisk eller mekanisk stimuli) nemt være delivered ovenfra. Det FIMTrack program designet til at matche magt FIM billeddannelse kan let vedtaget at spore Drosophila larver, C. elegans eller planarierne. Således og på grund af sin enkle og billige konstruktion (se http://FIM.uni-muenster.de), FIM billeddannelse er muligt for en bred vifte af biomedicinske anvendelser og giver navnlig et presserende behov for højt gennemløb studier.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for S. Thomas, som har igangsat dette projekt, J. Hermann og U. Burgbacher om hjælp i opbygningen af FIM setup. Dette arbejde blev finansieret af DFG (SFB 629 B6).
Name of the Material/Equipment | Source | Catalog Number | Comments |
FIM setup | Custom | details for construction or purchase of setups is available upon request | |
Acrylic glass plate | Custom | Additional for agar pouring | |
Heat radiator plate | Custom | Aluminum plate (paintet in matt black) perfusable on opposing sites with adjustable mounting | |
Water calorifier/cooling pumps and hoses | Custom | based on GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) and Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013) | |
Standard Camera (4 MP) | Basler | acA2040-25gm | Camera defaultly used for the FIM setup |
Test Camera (1.4 MP) | QImaging | 1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO) | Camera used for comparison |
Test Camera (0.8 MP) | Point Grey | Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS) | Camera used for comparison |
Test Camera (0.3 MP) | Sony | PS Eye USB2.0 camera | Camera used for comparison |
Computer | Custom | equipped with at least i5 Intel processor or better, 16 GB RAM and sufficient HDD storage space [>1TB] | |
Standard Fly food | Custom | ||
Standard Fly vials 135 ml | Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany | 78,895 | |
Petri dishes 9cm | Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany | 821,473 | |
Ultrapure deionized water | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | Synergy | |
NaCl | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 3957.2 | |
Food grade agar | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A0917,5000 | |
Paintbrush (small and large) | Milan | Aquarell 310 Size 0 and 2 | |
Pyrometer | Trotec | BP20 |