Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.
המטרה של ניתוח fluorometric היא לשמש ככלי עזר יעילים, חסכוני, תפוקה גבוהה של ניתוח phagocytosis ותהליכים תאיים אחרים. טכניקה זו ניתן להשתמש במגוון רחב של סוגי תאים, שני חסיד ולא חסיד, לבחון מגוון רחב של תכונות הסלולר. כאשר לומדים phagocytosis, טכניקת fluorometric מנצלת סוגי תאי phagocytic כגון מקרופאגים, וחלקיקי opsonized שכותרתו fluorescently הקרינה שיכולים להיות כבוי בנוכחות trypan הכחולה. בעקבות ציפוי של מקרופאגים חסיד ב96-גם צלחות, חלקיקי ניאון (ירוק או אדום) מנוהלים ותאים מותר phagocytose לכמויות שונות של זמן. בעקבות הפנמה של חלקיקי ניאון, תאים נשטפים עם trypan כחול, המאפשר הכחדה של אות ניאון מחיידקים אשר לא הפנימו, או שהם רק הקפדה על פני התא. בעקבות לשטוף trypan, תאים נשטפים עם PBS, קבועה,nd מגואלות DAPI (תווית ניאון כחולה גרעינית), המשמש לסימון גרעינים של תאים. על ידי כימות fluorometric פשוט באמצעות קריאת צלחת גרעינית (כחולה) או חלקיקי הקרינה (אדום / ירוקה) אנחנו יכולים לבחון את היחס של יחידות יחסית הקרינה של ירוק: כחולות ולקבוע מדד phagocytic מעיד על כמות חיידקי ניאון הפנימו לכל תא. משך assay באמצעות טפטפות שיטה ורבות ערוצים 96-גם לשטיפה, מסוף phagocytosis לסיים רכישת נתונים, הוא פחות מ 45 דקות. Cytometry זרימה יכולה לשמש באופן דומה, אך היתרון של fluorometry הוא התפוקה הגבוהה שלה, שיטה מהירה של הערכה עם מניפולציה מינימאלית של דגימות וכימות מהיר של עוצמת ניאון לכל תא. ניתן ליישם אסטרטגיות דומות לתאים שאינם חסיד, שכותרתו חיידקים חי, פילמור אקטין, ובעצם כל תהליך ניצול הקרינה. לכן, fluorometry היא שיטה מבטיחה עבור העלות נמוכה, הגבוה throughpיכולות ut במחקר של תהליכים תאיים.
כימות של אות ניאון כבר בשימוש נרחב במגוון רחב של שיטות מדעיות החל PCR, cytometry זרימה, מיקרוסקופיה confocal, וסריג ניתוח זמנית ELISA. יש הדמיה הקרינה וכימות יישום רחב והוא יכול להיות כלי נהדר לניתוח כמותי של תהליכים תאיים שונים. שימוש בסמני ניאון והאות שלהם כבר מהפכה בעשור האחרון, והופעתה של קוראי צלחת ניאון יש להקל כימות תפוקה הגבוה של הקרינה הנפלטת במהלך תהליכים תאיים.
ניתוח Fluorometric יכול לשמש כלי נהדר בכימות של phagocytosis. Phagocytosis נחקר מאז גילוי phagocytes ידי Metchnikoff בשנת 1800 1. במהלך השנים, במגוון שיטות כבר נוצל כדי לבחון תהליך חשוב זה חיוני להגנה חיסונית מולדת נגד פלישת חיידקים, נגיפיות, פטריות וטפילות פתוגנים 2-5. שיטות קודמות של מיקרוסקופיה כימות מנוצל וטכניקות stereological כדי להמחיש תאים הphagocytosing, שהיו לכמת אז על ידי ספירה של חלקיקים הפנימו (ידני או עם שימוש בתוכנה) 6-8. חסרונות מסוימים לבאמצעות מיקרוסקופ לבד לניתוח כמותי הם שספירה ידנית של חיידקים היא עבודה אינטנסיבית ונוטה יותר להטית משקיף. שיטה נוספת המשמשת בכימות של phagocytosis היא טכניקת המיקרוביולוגית של ציפוי של חיידקים מהתא lysates (להלן phagocytosis) על צלחות תרבית חיידקים, אך שיטה זו יכולה להיכשל לתת דין וחשבון למנגנונים ונוכחות של חיידקים הפנימו באופן חלקי bactericidal. שיטה זו היא עוד יותר עבודה אינטנסיבית בהשוואה למיקרוסקופיה ולוקחת כמה ימים כדי לנתח. נראה cytometry זרימה להיות דרך המהירה והיעילה ביותר לכימות phagocytosis ונוצל על ידי קבוצות רבות 9-11, אבל העלות הגבוהה נפוצה הקשורים במחוונים דרושים לניתוח עושה את זה בשיטה יקרה ביותר בהשוואה למבחנים שהוזכרו קודם לכן.
שיטת fluorometric היא אלטרנטיבה טובה לcytometry זרימה לניתוח של הפנמת חלקיקים שכן הוא מציע כימות משוחד של ציוד הקרינה באמצעות שאינו כעלותו. יתרונות נוספים אחרים של fluorometry הם יעילות גבוהה, ויכולות תפוקה גבוהות לכימות הקרינה הנפלטת על ידי שכותרתו החלקיקים הפנימו.
יתרונות של fluorometry ניתן להסיק לכימות של תהליכים אחרים מאשר phagocytosis. לדוגמא, ניתוח fluorometric ניתן ליישם ללמוד כל תהליך מוביל לשינויים בביטוי של תאית או קולטני קרום הנכנס, שינויים בתא חדירות / כדאיות, יעילות transfection, ואפנון בפילמור אקטין. חיסרון אחד של טכניקת fluorometric הוא ש, בהתאם לתוויות שימוש, ייתכנו גבוהניסוי לניסוי שונות אשר בדרך כלל ניתן לפתור על ידי הוכחת נתונים באמצעות כימות יחסי, כגון שינוי קיפול או עליית אחוזים מהשליטה.
מגבלות עיקריות של טכניקת fluorometric הן שונות ניסיוני כמו גם אובדן תא הקשורים לכביסה ושימוש בתאים שאינם חסיד נרחבים.
שונות הוא ציינה בעיקר בשל השינוי בחלקיקי ניאון כמו המשקל וpipetting במהלך תקופת ההכנה של מניות הפתרון הוא לא דרך של שמירה…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank the following funding sources: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (to S.R) and F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (to J.N.).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
1-μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres; | Molecular Probes | F8852 | combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate | Molecular Probes | E2861 | reconstitute (5 mg) in 50μl of PBS and combine with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
Opsonizing reagent | Molecular Probes | E2870 | |
Rhodamine phalloidin | Molecular Probes | R415 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
the items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers | |||
RPMI Cell growth media | Gibco | Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/Streptomycin; warm in 37oC before use | |
Fluorescent plate reader-Fluostar Omega | BMG Labtech | ||
Paraformaldehyde (16%) | Fischer Scientific | AA433689M | dilute to 4% before use |
96 well plates | Greiner | 655097 | clear or black or clear bottom – black plates |
Multichannel pipette (8-12 channels) | |||
Reagent reservoirs | |||
1x PBS | |||
Microfuge tubes (0.6 ml) | |||
Conicles (10 ml) |