الأزهار وتراجع التحول من الكتان (<em> LINUM usitatissimum</em>) لتوليد المعدلة وراثيا السلالات مع معدل التحويل عالية
Summary
هنا، نقدم بروتوكول لتحويل الكتان باستخدام الأجرعية تحول النبات بوساطة عبر الأزهار وتراجع. هذا البروتوكول هو بسيط لأداء وغير مكلفة، ولكن ينتج معدل التحول أعلى من الأساليب المتاحة حاليا للتحول الكتان.
Abstract
الأجرعية بوساطة تحول النبات عن طريق الأزهار وتراجع هو أسلوب يستخدم على نطاق واسع في مجال تحول النبات وتم الإبلاغ عن أن تكون ناجحة للعديد من الأنواع النباتية. ومع ذلك، لم يتم الإبلاغ الكتان (LINUM usitatissimum) التحول من الأزهار وتراجع. والهدف من هذا البروتوكول هو لإثبات أن الأجرعية وطريقة الأزهار وتراجع يمكن استخدامها لتوليد الكتان المعدلة وراثيا. وتبين لنا أن هذه التقنية بسيطة وغير مكلفة وفعالة، والأهم من ذلك، يعطي معدل التحول أعلى من الأساليب المتاحة حاليا للتحول الكتان.
وباختصار، فقد انخفض النورات من الكتان في حل من الأجرعية تحمل البلازميد ثنائي الموجه (جزء T-DNA بالإضافة إلى إدراج تسلسل LINUM، LIS-1) ل1 – 2 دقيقة. كانت قد وضعت النباتات شقة على جانبهم لمدة 24 ساعة. ثم، تم الحفاظ على النباتات في ظل ظروف النمو الطبيعي حتى علاج المقبلة. بروسسوتكررت الصورة من غمس 2-3 مرات، مع ما يقرب من 10-14 فترات اليوم بين غمس. تم جمع بذور T1 ونبتت على تربة. بعد ما يقرب من أسبوعين، تم اختبار السلالات تعامل من قبل PCR المباشر؛ واستخدمت 3 الأوراق للنبات بالإضافة إلى الاشعال T-DNA المناسبة – 2. تم اختيار transformants إيجابية ونمت حتى تاريخ الاستحقاق. وكان معدل التحول عالية بشكل غير متوقع، مع 50 – 60٪ من البذور من النباتات المعاملة يجري transformants إيجابية. هذا هو معدل التحول أعلى من تلك التي ذكرت لthaliana نبات الأرابيدوبسيس والأنواع النباتية الأخرى، وذلك باستخدام التحول الأزهار وتراجع. بل هو أيضا أعلى، والتي تم الإبلاغ حتى الآن، للتحول الكتان باستخدام طرق أخرى للتحول.
Introduction
الكتان (LINUM usitatissimum) هو المحصول المهم نمت على نطاق واسع للألياف والزيوت. التحول من الجينوم الكتان هو ممكن مع تقنيات مثل إصابة أو عدوى الأجرعية، وشارك في زراعة في زراعة الأنسجة، وتطبيق الجسيمات biolistic أو صوتنة الموجات فوق الصوتية تليها التجدد. ومع ذلك، هذه التقنيات لها عيوب كثيرة، بما في ذلك الميل إلى العديد من الأحداث طفرية وتمديد الوقت للحصول على خطوط المعدلة وراثيا. يمكن أيضا أن تكون بعض من هذه الطرق مكلفة وتتطلب معالجة المهرة وكفاءة الصكوك، مما أدى إلى انتعاش الشتلات منخفضة. الأهم من ذلك، هذه التقنية غالبا ما يؤدي إلى انخفاض معدلات التحول 2،6.
الأجرعية بوساطة تحول النبات عن طريق الأزهار وتراجع هو نهج بسيطة وفعالة لتوليد النباتات المعدلة وراثيا. تم بشكل روتيني وبنجاح استخدامه للعديد من الأنواع النباتية مثل نبات الأرابيدوبسيس thalianعلى 1،4، فصة برميلية 11، الطماطم 12، 13 القمح والذرة 10. ومع ذلك، لم يعتقد أنه من كتقنية قابلة للتحول الكتان بسبب عدة عوامل، مثل انخفاض عدد الزهور التي تنتجها الكتان، عدد محدود من البذور تم الحصول عليها من كل زهرة، وحجم البذور واسع، ومعطف سميك، والتي يمكن أيضا أن يكون مشكلة لمثل هذه عملية التحول الوراثية. بالإضافة إلى ذلك، والجزء اختيار تقنية الأزهار وتراجع يتطلب الإنبات بذور حولت على وسائل الاعلام النباتات التي تحتوي على مضاد حيوي، مع السلالات تحولت حاليا على أساس قدرتها على الإنبات والبقاء الأخضر، في حين أن السلالات غير حولت إما لا تنبت أو تنبت ولكن التبييض بسرعة ويموت. في الأدب الحالي، وقد لوحظ أن من النوع البري الكتان يميل إلى الهروب تركيز عال من الاختيارات للمضادات الحيوية، وإنتاج نتائج إيجابية كاذبة، وجعل اختيار السلالات T1 مقرهاعلى مقاومة المضادات الحيوية أكثر صعوبة 6،14. أيضا، عندما أضيف على نسبة عالية من المضادات الحيوية إلى وسيلة الاختيار، ومعدل التحول الملحوظ انخفض بشكل كبير 9.
في هذا البروتوكول، استخدمنا الأجرعية وطريقة الأزهار وتراجع لتحويل خط من ألياف الكتان، ستورمونت المعلاق (استجابة والبلاستيك)، وهو ما ثبت للرد على الضغوط في البيئة عن طريق تغيير الجينوم 3،5. للتغلب على مشكلة هروب المضادات الحيوية، اخترنا أن تفعل اختبار PCR المباشر من الحمض النووي من أوراق T1، بدلا من اختيار طريق إضافة المضادات الحيوية إلى وسائل الإعلام النبات. ونحن قد استفادت من تشريح بسيط من الكتان لتتبع الزهور محددة في وقت العلاج. يسمح هذا النظام تتبع اختيار البذور من الزهور محددة والإنبات في التربة دون إضافة المضادات الحيوية. وقد تم تحديد transformants إيجابية ببساطة عن طريق اختبار DNA الحصول عليها من الأوراق باستخدام طريقة سريعة وفعالة سو PCR المباشر. وتظهر نتائجنا أن طريقة الأزهار وتراجع عملت بشكل جيد جدا في هذا الخط من الكتان ونتج من المستغرب في معدل التحول عالية جدا (50 – 60٪)، وهي نسبة أعلى من تلك التي لوحظت من قبل لthaliana نبات الأرابيدوبسيس، الذي تشير التقارير إلى أن 0،1-1 ٪ 1، وأعلى أيضا من الأنواع النباتية الأخرى 10،12. نحن أيضا اختبار صنف آخر من بذر الكتان (الكتان النفط)، بيتون (مستقر وغير مستجيبة)، وتشير البيانات الأولية لدينا أن الأزهار وتراجع يعمل أيضا لهذا التنوع من الكتان.
والهدف من هذا البروتوكول هو إظهار أن الأجرعية والأزهار وتراجع يمكن استخدامها لتوليد الكتان المعدلة وراثيا. وتبين لنا أن هذه التقنية بسيطة وغير مكلفة، وأسرع من غيرها من أساليب التحول الكتان. والأهم من ذلك أنه يؤدي إلى معدل التحول أعلى بكثير من غيرها من أساليب التحول الكتان 2،6. تشريح نبات الأرابيدوبسيس thaliana، التي لديها العديد من الفروع والزهور، يا أماهKES من الصعب التمييز تراجع والزهور غير مغموسة على نفس النبات. لذلك، فإن أعدادا كبيرة من البذور، وحوالي 20،000 البذور للنبات، تحتاج إلى فحص لتحديد transformants إيجابية 8. الكتان، من ناحية أخرى، لديها عدد أقل من الفروع (فرع رئيسي واحد وعدد قليل من فروع جانبية) وعدد أقل من الزهور، وتنتج ما يقرب من 100 البذور في النباتات، مما يجعل من الممكن لتتبع الزهور الفردية واختيار البذور محددة خلال عملية الفرز.
ونقترح أن الأزهار وتراجع هو وسيلة قابلة للتطبيق لتحويل أي نوع من الأنواع ذات الصلة من الكتان، وهو جنس من حوالي 200 نوع. هذه الطريقة يعطي أعلى بكثير معدل التحول من الأساليب الأخرى للتحول الكتان. نحن نقترح أيضا أن فحص PCR المباشر من T1 ورقة DNA هو وسيلة فعالة للتغلب على مشكلة هروب المضادات الحيوية المقاومة التي غالبا ما تنتج العديد من ايجابيات كاذبة. فحص PCR المباشر يمكن تطبيقها على أي نوع من الأنواع النباتية الأخرى وليس ر يقتصرس الكتان. تقنية تتبع البذور بسيطة العاملين في هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على أي نوع من الأنواع النباتية الأخرى مع المتفرعة التشريح مماثلة لالكتان.
Protocol
Representative Results
Discussion
في بعض الأنواع النباتية، مثل الكتان (LINUM usitatissimum)، كان ناجحا تحول النبات محدود. سابقا، والتحول في الكتان ويتطلب وجود عدوى الأجرعية التي كتبها جرح وزراعة المشترك، تطبيق الجسيمات biolistic أو باستخدام الموجات فوق الصوتية صوتنة، تليها تجديد. عملية في آن معا منذ فترة طويلة وعرضة للأن يرافقه العديد من الأحداث طفرية. وعلاوة على ذلك، فإن عملية اختيار هذه التقنيات تتطلب استخدام علامات اختيار المضادات الحيوية مثل الكانامايسين. ومع ذلك، فقد لوحظ في الأدب أن هذا الأسلوب في اختيار تنتج العديد من ايجابيات كاذبة، كما يميل الكتان للهروب تركيزات عالية من المضادات الحيوية 6،9،14. وكان ثمة عيب آخر من التقنيات السابقة في التحول الكتان انخفاض معدلات التحول 2،6.
في بروتوكول الموصوفة هنا، وقد تبين الأجرعية تحول النبات بوساطة عبر الأزهار غمسأن يؤدي إلى معدل التحول عالية لالكتان (50 – 60٪). وقد تم الحصول على Transformants من الزهور انخفض والتي تم جمعها من الفروع الرئيسية والجانبية. وقد تم اختيار transformants إيجابية ببساطة عن طريق زراعة النباتات T1 على التربة وفحص أوراقها قريبا بعد أن نبتت، واستخدام المضادات الحيوية-اختيار المارة، وهي خطوة المستخدمة سابقا كقاعدة في الأزهار وتراجع للأنواع النباتية الأخرى. عن طريق إجراء اختبار PCR المباشر من الأوراق، وباستخدام بادئات T-DNA المناسبة، transformants إيجابية يمكن اختيار بسرعة. هذه التقنية بسيطة وغير مكلفة وسهلة لأداء، ولكن النتائج في معدل التحول أعلى بكثير من تلك التي ذكرت سابقا لنبات الأرابيدوبسيس والأنواع النباتية الأخرى باستخدام هذه الطريقة 1،10،12. بل هو أيضا أعلى معدل التحول الإبلاغ عنها من الكتان.
ومع ذلك، هناك خطوات حاسمة في الإجراءات بما في ذلك اختيار أفضل مرحلة زهرة وأفضل تركيز بالسطح، بحيثوالأجرعية يمكن أن تخترق الخلايا النباتية دون قتل أجهزة زهرة. إذا تم استخدام مرحلة برعم في وقت مبكر (الشكل 2A) مع ارتفاع تركيز Silwet-77 أكثر من 0.05٪، وزهرة لم تتطور ولا تعيين البذور. إذا تم استخدام مرحلة أواخر برعم (الشكل 2C)، على الرغم من أن التحول قد عمل، وسوف تحدث بمعدل أقل من ذلك بكثير. وتم الحصول على نتائج مماثلة مع نبات الأرابيدوبسيس تراجع الأزهار التحول 1،4. لهذا البروتوكول، تم اختبار جميع المراحل الأزهار مع مختلف Silwet-77 تركيزات وتم تحديد أفضل مرحلة لتكون المرحلة برعم المتوسط (الشكل 2C) مع Silwet-77 في 0.05٪ لغمس الأول، تليها غمس الثاني في المرحلة الراحل برعم (الشكل 2C) مع انخفاض طفيف تركيز Silwet-77 من 0.03٪. كما عملت التحول جيدا باستخدام المرحلة برعم في وقت مبكر (الشكل 2A) مع تركيز منخفض silwet-77 من 0.003٪ تلاهغمس الثاني مع مرحلة برعم المتوسط (الشكل 2B) في أعلى Silwet-77 تركيز 0.05٪.
في هذا البروتوكول، وقد حاول بعض المعالم الأخرى لتحسين معدل التحول، ولكن وجد أن له أي آثار على النتيجة النهائية. وتشمل الأمثلة يمتد الوقت بعد غمس أن النباتات تكمن في جانبهم وغطت في البلاستيك من يوم واحد إلى يومين. باستخدام OD أكثر من 1 للثقافة الأجرعية، بدلا من 0،5-1. زيادة الوقت غمس 5 – 15 دقيقة بدلا من 1 – 2 دقيقة. مرة أخرى نحن لم نلحظ أي تأثير على معدل التحول باستخدام هذه الاستراتيجيات. العوامل الأكثر فعالية، ومع ذلك، وجدت أن استخدام النباتات الصحية في المراحل زهرة الصحيحة، واستخدام أفضل تركيز Silwet-77. لاحظنا أن اثنين من فترات غمس، ويعمل بطريقة أو بأخرى الوقت أفضل من واحد، على الرغم من واحد غمس الوقت يعمل أيضا.
لا يمكن أن يتحقق تعديل على هذا البروتوكول من قبل reducin ز تركيز Silwet-77 إلى أقل من 0.003٪ في غمس الثاني أو الثالث. منذ Silwet-77 غير سامة، وارتفاع جدا نتائج تركيز في الزهور النامية على نحو رديء، مما يؤدي إلى أي محصول البذور. يمكن الحد من وتيرة غمس إلى واحد، مع الأحداث الثانية أو الثالثة القضاء إذا النباتات لا يبحثون صحي والبراعم لا تتطور بصورة جيدة.
وهناك أوجه القصور الرئيسية لهذه التقنية هو انخفاض عدد الزهور التي تنتجها الكتان، وعدد محدود من البذور تم الحصول عليها من كل زهرة، ودورة حياة طويلة من الكتان. يستغرق 6-8 أسابيع من بذر البذور لديها براعم الأولية جاهزة لغمس أول وإضافية 8-10 أسابيع بعد غمس-للوصول الى جيل T1. في المجموع، ومجموعة من 5 – هناك حاجة إلى 6 أشهر للحصول على الجيل T1. على عكس الأنواع النباتية الأخرى، والتي زهرة في أي وقت من السنة، وبعض أصناف الكتان زهرة أفضل في أوقات محددة من السنة. تخطيط مدروس جدا لهذا الأسلوب هو المهم.
<p clالحمار = "jove_content"> وباختصار، نتائجنا من تراجع الأزهار مع اثنين من أصناف الكتان مختلفة: الكتان من الألياف، ستورمونت سيروس (البلاستيك استجابة و)، وزيت الكتان، بيتون (مستقر وغير المراعية)، تبين أن الأجرعية – بوساطة تحول النبات عن طريق الأزهار وتراجع هو وسيلة قابلة للتطبيق وفعالة للتحول الكتان، ويمكن استخدامها لتحل محل التقنيات المستخدمة سابقا للتحول الكتان. فإن إدخال تعديلات على طريقة الأزهار وتراجع في هذا البروتوكول تكون قابلة للتطبيق للاستخدام مع أي نوع من الأنواع النباتية الأخرى وليس على سبيل الحصر الكتان.Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Ogelbay fund.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL) | |||
| 5" pots | |||
| potting soil | |||
| greenhouse with appropriate light setting | |||
| Thermocycler | |||
| Agarose gel electropheresis equipment | |||
| digital imaging setup | |||
| Silwet-77 | LEHLE SEEDS | VIS-01 | Toxic, wear gloves |
| GoTaq Green Master Mix | promega | Part# 9PIM712 | |
| Terra PCR Direct Polymerase Mix | Clontech | 639270 | |
| Binary vector PRI 909 | Takara | 3260 | |
| Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E | Takara | 9115 | |
| TOPO TA cloning kit | invitrogen | K4595-01 | |
| sucrose | fischer scientific | ||
| electroporator and cuvettes | bio-Rad | 165-2092 | |
| Shaker | |||
| spinner | |||
| platic wrap and aluminum foil wrap | |||
| speedSTAR DNA polymerase | Takara | RR070A/B | |
| QlAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAGEN plasmid mini kit | Qiagen | 12123 | |
| SalI-HF enzyme | NEB | R3138S | |
| SacI-HF enzyme | NEB | R3156S | |
| T4 DNA ligation kit | NEB | M0202 | |
| Murashige Skoog | sigma | M5524 | |
| Agar | fisher scintific | A360-500 |
Referenzen
- Bent, A. Arabidopsis thaliana floral dip transformation method. Methods Mol Biol. 343, 87-103 (2006).
- Beranova, M., Rakousky, S., Vavrova, Z., Skalicky, T. Sonication assisted Agrobacterium-mediated transformation enhances the transformation efficiency in flax (Linum usitatissimum L.). Plant Cell Tiss Organ Cult. 94, 253-259 (2008).
- Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by environment. New Phytol. 167, 171-180 (2005).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).
- Cullis, C. A. Mechanisms and Control of Rapid Genomic Changes in Flax. Ann Bot. 95, 201-206 (2005).
- Dong, J. Z., McHughen, A. An improved procedure for production of transgenic flax plants using Agrobacterium tumefaciens. Plant Sci. 88, 61-71 (1993).
- Logemann, E., Birkenbihl, R. P., Ulker, B., Somssich, I. S. An improved method for preparing Agrobacterium cells that simplifies the Arabidopsis transformation protocol. Plant Methods. 2 (16), (2006).
- Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. Floral-dip transformation of Arabidopsis thaliana to examine pTSO2::β-glucuronidase reporter gene expression. J Vis Exp. (40), (2010).
- Mlynarova, L., Bauer, M., Nap, J. -. P., Pretova, A. High efficiency Agrobacterium-mediated gene transfer to flax. Plant Cell Rep. 13, 282-285 (1994).
- Mu, G., et al. Genetic transformation of maize female inflorescence following floral dip method mediated by agrobacterium. Biotechnology. 11 (3), 178-183 (2012).
- Trieu, A. T., et al. Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium. Plant J. 22 (6), 531-541 (2000).
- Yasmeen, A., et al. In Planta transformation of tomato. Plant Mol Biol Rep. 27, 20-28 (2009).
- Zale, J. M., Agarwal, S., Loar, S., Steber, C. M. Evidence for stable transformation of wheat by floral dip in Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Rep. 28, 903-913 (2009).
- Zhan, X. C., Jones, D. A., Kerr, A. Regeneration of flax plants transformed by Agrobacterium rhizogenes. Plant Mol Biol. 11, 551-559 (1988).
